利用流式细胞仪增强细菌研究

将流式细胞仪添加到您的平台库中进行微生物研究可以阐明传统大量观察所未见的方面。各行各业使用流式细胞仪研究微生物生物学,如生物医学科学,食品安全和遗传学。流式细胞仪可以帮助临床医生检测细菌感染并确定对抗生素的易感性,公共卫生机构使用流式细胞仪检测水或食物中的致病菌,流式细胞仪也可用于利用细菌作为载体进行遗传研究。用于检查细菌的常规方法基于在琼脂上生长时对单细胞形态或集落特征的观察。然而,高灵敏度的流式细胞仪提供了检测和分析微生物的工具,与其可培养性无关,因为并非所有微生物都会在琼脂上同等生长。在这里,我们将重点介绍使用流式细胞仪进行微生物研究的一些优势,并概述一些实验提示和技巧,以便快速启动您的研究。

使用流式细胞仪进行微生物研究的好处

单细胞分析

流式细胞术是一种允许人们快速和单独分析细菌的技术,同时提供微生物异质性的定量分析。传统的单细胞细菌分析方法在分析单个细胞的能力方面受到限制,而耗时的显微镜限制了可以分析的细胞总数。另一方面,流式细胞术能够每秒分析数千个细胞,改善统计学,并允许量化独特和稀有细胞类型。

**细胞计数

使用流式细胞仪进行细菌细胞计数与传统计数方法(例如显微镜检查,细胞质量测定或光密度读数)相比,在速度和准确度方面具有显着优势。流式细胞仪可以通过直接体积计数或添加计数珠来获得微生物的细胞计数。此外,通过将细胞计数与其他测量(例如生存力或大小)偶联,可以容易地确定特定细胞亚群的细胞计数。

多参数分析

使用流式细胞仪进行细菌鉴定的一个优点是能够进行多参数分析。光散射特性可以揭示细菌的大小(FSC)和复杂性(SSC),然而,通过与特定荧光染料(例如DNA含量,细胞活力和膜电位)同时分析可以获得额外的信息。这些附加参数可以为细胞健康,生长以及区分混合培养物中不同种类细菌的能力提供有价值的见解。

使用流式细胞仪分析细菌的提示和技巧

在流式细胞仪上检测细菌

适当的PMT电压设置/范围

流式细胞仪能够分析从大的培养细胞系到小于1μm的微生物的各种各样的颗粒。许多仪器不能同时收集大范围的信号,因此必须优化光电倍增管(PMT)电压设置以确保正确收集样品,尤其是细菌等小颗粒。一些新的流式细胞仪,例如NovoCyte®,具有广泛的信号检测范围,无需进行复杂的PMT电压调整,传统上仅供有经验的人使用。使用具有这种宽动态范围信号检测的流式细胞仪简化了实验设置,并确保了足够的PMT设置,适用于广泛的检测。

正确的阈值设置

流式细胞仪图

图1.使用NovoCyte®流式细胞仪检测天然水中的细菌将
新鲜天然水通过300目筛过滤,用去离子水稀释(通过0.1μm膜过滤)**所需浓度。向样品中加入100xSYBR®GreenI染料,在37℃下孵育13分钟,并在NovoCyte流式细胞仪上获得。绿色与红色的情节通过细菌与背景区分。在每个样品中自动获得**计数。

为确保信号收集是特定的,使用阈值来消除背景噪声。阈值是电子障碍,它建立了是否记录事件的标准。正确确定阈值非常重要,因为任何不符合此标准的内容都不会显示或保存以供分析。前向或侧向散射通常用作阈值参数,因为不需要额外的试剂。然而,细菌可能因其尺寸小而成为问题,并且难以将它们与背景或碎片区分开来。如果是这种情况,建议使用荧光信号(即荧光触发)设置阈值,以专门识别细菌并确保与碎片分离。通过荧光进行的细菌检测通常包括与核酸结合的染料,例如SYBR Green I,Sytox Green I等。用SYBR Green荧光引发以检测水中的细菌污染,如图1所示。该图显示了细菌的充分区分。由电子噪声和无机粒子引起的背景。总之,使用适当的阈值设置,您可以确保样品的质量数据采集。

在流式细胞仪上获得细菌细胞计数

流式细胞术也可用于获得准确的**细胞计数,或整个群体或细胞亚群中细胞的浓度。目前,大多数流式细胞仪依赖于计数微珠作为参考颗粒来计算细胞计数,然而,一些流式细胞仪具有直接体积细胞计数而无需计数珠子。这两种方法都可以产生精确和准确的**细胞计数,但直接体积计数可以提供细胞计数,而无需额外的试剂或增加实验复杂性。计数珠具有确定的浓度,其允许获取一定数量的珠子事件,并使用该数量来计算样品中的细胞浓度。计数珠子有各种尺寸,有荧光和没有荧光。如果您打算使用荧光触发,那么使用具有类似荧光的计数珠也很重要。对于直接体积计数,通过流式细胞仪自动计算细胞浓度,无需任何额外步骤,通常使用非常精确的注射泵。总的来说,两种细胞计数方法都会产生快速且易于实现的**计数。

细菌的多参数分析

虽然单独的光散射可以提供有价值的信息,但使用特定荧光染料或标记物的多参数分析的添加提供了关于活力,代谢活性,细胞应激反应和细胞周期分析的进一步见解。但是,在使用荧光分析细菌时,需要记住一些重要特性。对于细菌而言,细胞分析所需的荧光试剂可能与哺乳动物细胞不同,或者可能需要改变使用的浓度。细菌的大小,质量,核酸和蛋白质含量约为哺乳动物细胞数量的1/1000,因此信号可能受到影响。细菌在与细胞计数用试剂的相互作用中也往往与真核生物的行为不同; 这可能是由于试剂的摄取和流出不同引起的,这些试剂受到细胞壁结构的影响以及可能与真核生物中的那些不相似的孔/泵的存在。其中一个例子是革兰氏阴性细菌的外膜排除了更多的亲脂性和亲水性分子,通常用于测量膜电位。因此,重要的是凭经验确定细菌染色所需的试剂浓度,并确保其可用于微生物分析。

结论

包括用于微生物研究的流式细胞术可以增强实验结果,提供执行单细胞多参数分析以及**细胞计数的能力。使用本说明中提供的技巧将有助于防止流式细胞仪上微生物分析中出现的许多缺陷。

Lauren Jachimowicz是ACEA Biosciences的应用开发科学家。

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