下一代测序的样品数量和质量控制

输入样品的数量和质量是下一代测序中成功制备文库的两个关键考虑因素。高质量的文库是减少测序偏倚和提供可靠序列覆盖的重要因素。因此,样本输入的强大量化和质量控制程序对于确保通过工作流程获得一致结果和**大化序列发生器吞吐量**关重要。

特殊性,灵敏度,所需样品量,成本和速度等因素都是选择QC方法时需要考虑的重要因素。了解荧光和吸光度定量技术的优势和局限并适当使用它们将确保成功的质量控制工作流程。

微量体积UV-Vis吸光度

通过吸光度定量核酸是通过分析透过样品的光量来进行的。核酸的吸收峰在260nm,并且在该波长下吸收的光量可以直接用于使用Beer-Lambert方程计算样品的浓度。

吸光度还提供样品污染的指示,因为吸收光谱的形状将基于吸收与目标分子相同或接近相同波长的其他分子的存在而改变。

对于基因组学和蛋白质组学应用,微量分光光度计是优选的,因为测量快速,样品体积要求**小(1μL或更低),并且消除了对样品稀释的需要。

使用吸光度方法定量核酸的一个限制是260nm处的峰值吸光度对于所有核酸种类是常见的。例如,dsDNA样品中任何污染的ssDNA,RNA,游离核苷酸或寡核苷酸都会增加报告的浓度。因此,单独的吸光度方法**适合于纯化样品的定量。

荧光定量

荧光方法通常使用对目标生物分子具有选择性的荧光团。当与靶标结合时,荧光团显示增强的荧光,允许特异性检测目标分子。

荧光测定使用该结合特异性来建立样品发出的荧光量与溶液中感兴趣的生物分子浓度之间的直接相关性。通过将荧光团与已知浓度的样品混合并测量相对荧光单位(RFU),可以绘制浓度和测量的RFU之间的关系并将其用作标准曲线。然后可以将与未知样品结合的相同荧光团的发射相对于该标准曲线作图,以确定样品浓度。

荧光检测的选择性是荧光的关键优势,使研究人员能够确保定量数据特异于其感兴趣的样品。

Denovix触摸屏

预定义的应用程序可以快速,轻松地测量吸光度和荧光,以及强大的数据导出功能

由于荧光团的高消光系数,荧光测定也非常敏感。例如,使用DeNovix DS-11 FX和dsDNA定量分析,可以检测原始样品中低**0.5 pg /μL的dsDNA浓度。与微量吸收方法相比,这是灵敏度提高1000倍以上。

大多数下一代测序仪供应商建议通过分析物特异性荧光测定法(如DeNovix,PicoGreen或Qubit测定)对输入样品进行定量。这些方法利用对dsDNA特异的染料,并且不与可能存在的其他核酸种类结合。

纯度评估

除了进行准确的定量外,评估样品的纯度以确保它们不含潜在的酶抑制剂也很重要。蛋白质,EDTA,苯酚,盐和多糖等污染物会对随后的酶促反应产生负面影响,导致产量下降,覆盖率不均匀或不良,甚**造成文库制备失败。建议使用微量体积UV-Vis吸光度法进行样品质量控制。通过评估260 / 280nm和260 / 230nm测量的比率,可以推断出样品中杂质的程度和性质的信息。

概要

吸光度方法的优点

  • 快速测量,无需化验成本。直接测量样品,无需设置分析或测量标准曲线。
  • 动态范围宽。对于**灵敏的微量体积分光光度计,检测下限为0.75 ng /μLdsDNA(DS-11系列,DeNovix)。通过缩短光程(光穿过样品的距离),可以测量越来越浓的样品。目前,微量吸收的检测上限为37,500 ng /μLdsDNA。
  • 样品纯度评估。通过分析260/230和260/280比率可以获得样品质量信息。

荧光法的优点

  • 特异性。荧光定量分析特异性结合目标分析物,结果受常见污染物的影响较小。
  • 敏感度。使用荧光分析,检测限可比微量吸光度低1,000倍。

结论

吸光度和荧光是不同但是用于样品定量的互补方法。对于NGS实验室,结合荧光和吸光度方法使研究人员能够获得PCR前后样品质量控制的定量和定性信息,同时使用**少量的样品。

例如,荧光定量确认是否有足够的dsDNA模板用于文库制备,并且260 / 230nm和260 / 280nm吸光度比能够评估潜在的抑制性污染物。

使用吸光度和荧光的浓度测量之间的差异也可以提供仅在分离目标核酸时提取效率的广泛指示,因为吸光度值还将包括所有核酸的吸光度(单核苷酸,寡核苷酸,RNA, dsDNA或ssDNA)。

为了满足下一代测序实验室的不同需求,DeNovix提供DS-11系列仪器。DS-11 FX独特地结合了微量吸光度和荧光测量模式。每种方法的独立系统也可在该范围内使用,非常适合在PCR前和PCR后具有特定量化要求的实验室。

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