qPCR检测设计和优化提示

技巧1:知道该期待什么。以低浓度表示的目标难以检测,例如野生型背景中罕见的突变等位基因。从仅移取一个或几个分子的固有可变性将产生随机结果。此外,每个测定将具有灵敏度的限制,在该灵敏度下目标序列不能可靠地检测。该阈值严格依赖于探针化学,试剂质量和酶效率。如果灵敏度极限没有得到适当的表征,那么对数据的解释就会受到影响,并且变得比定量更加定性。为了验证目标样本是否存在于正在研究的样本中,可以考虑应用替代技术。
 
提示2:具体设计。软件只有在输入的时候才是好的,并不能说明调查的所有生物因素。该测定是否应该跨越外显子 - 外显子连接以更好地分析基因表达?它应该检测所有异构体还是只有一个选择性剪接的子集?是否有必须区分或容忍的同源序列?额外的生物信息学分析将有助于避免脱靶扩增,但选择合适的遗传方法对于确保适当的结果也很重要:荧光探针或DNA结合染料?等位基因特异性探针或引物?软件算法无法控制所有意外情况,例如意料之外的变化,因此基线故障率在重新测定设计时是不可避免的。
 
技巧3:选择适合实时热循环仪的染料。小编发现比FAM更长的波长应该与仪器光学元件仔细匹配。这些荧光团通常在解决重叠信号变得**关重要时用于多路复用。单波长激发源和窄带通滤波器限制了可以容纳的染料,而光谱中的细微差异干扰了解卷积算法。请参考仪器文件和染料建议,尤其是因为pH和温度依赖性会降低染料强度。设计用于微阵列或蛋白质标记的荧光团可能在qPCR中不能很好地工作。
提示4:根据应用选择您的聚合酶或主混合物。应用的例子包括多个目标一致的多路扩增,等位基因区分的不匹配区分和后续操作的高保真PCR。如果您的目标序列是细菌基因,请注意,许多聚合酶制剂都含有污染细菌DNA,从而不能检测到稀释的目标样本。
 
提示5:使用阳性对照验证新的检测设计。不管测定的设计如何,它可能不会产生预期的结果。使用适当的对照,要么是经过仔细定量的质粒,要么是已知基因表达的细胞系,以验证提取后核酸的质量和检测的性能特征。如果设计得当,两种针对同一基因的不同检测方法应产生相似的CQ值。裁员将增强人们对结果的信心。
 
提示6:准则或神话?大部分PCR过程仍然是个谜,特别是在**早的扩增循环过程中。分析设计建立在部落知识的基础上,其中一些建议有疑问,其他则不可侵犯。探针必须在比引物高10℃的温度下结合的规则使用热力学标准进行开发。
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