超声波细胞粉碎机在高通量测序片段化DNA 中的应用

随着技术的发展,遗传信息及其表达调控的研究 手段越来越多,高通量测序技术是其中**有效的手段 之一[1-5]。目前,利用高通量测序手段研究生物遗传 信息和基因表达调控信息已相当普及[3-7]。 然而,测 序前需要先制备适当大小 DNA 片段的样本文库。因 此,测序前需要对基因组 DNA 进行破碎,使其片段长 度满足测序要求[7-9]。RNA-seq对测序片段的长度 要求也和 DNA 高通量测序的一样[3-4]。 目前三大主 流测序平台的平均测序读长基本在100~400bp范围 内。其中Ilumina测序平台更是主流中的主流,其测序片段的读长是150bp×2,其双端测序需要的样本 DNA 片段长度为300bp 左右。 片段太长或太短,都
 
不能经济有效地实现高通量测序过程。 如片段太长,会在固定 DNA 到固体基质上时的效率低下且影响后续的测序效果、降低测序量。如果片段太短,则会导致测序读长偏短、增加测序成本和后续拼接的工作量。
 
因此,测序前**先要获得高质量的核酸片段。通常,基因组 DNA 或 RNA 片段化的主要仪器是价格昂贵的
 
超声波破碎仪,而大部分研究者的实验室并没有。 因此,如何利用一般实验室现有条件实现 DNA 的片段化以满足高通量测序的需要成为亟待解决的问题。
本文主要关注的是普通超声波细胞粉碎机破碎 DNA 样本的应用与技巧,并通过琼脂糖凝胶电泳、
 
2100生物分析仪对超声片段化的 DNA 样本及其后甲
 
基化**共沉淀(methylationimmunecoprecipitati-on,MeDIP)和羟甲基化**共沉淀(hydroxylmethyl-ationimmunecoprecipitation,hMeDIP)获得的样本进
 
行质量分析,评价普通超声波细胞粉碎机在高通量测序中应用的可行性。
1 材料和方法
 
1.1 材料与试剂 肝癌组织和癌旁组织(取自实验室自己构建和饲养的肝癌模型小鼠),精巢组织(取自购买于江苏省赣榆河蟹养殖场的河蟹幼蟹)。DNA 组织
样品保存液(GT21234,北京华越洋),美** Parafilm 封口膜(PM-996),Tiangen 血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒(DP304),Gelred(美**BIOTIUM)。 1.2 仪器 BILON92-IID 型超声波细胞粉碎机(上
 
海比朗仪器有限公司),凝胶成像系统 ChemidocXRS
 
(美**伯乐),NanophotometerPearl微量核酸蛋白分
 
析仪(德**Implen),真空离心浓缩仪(德** Eppen-dorf),DYCP-31CN 型琼脂糖水平电泳仪(北京六
 
一),安捷伦 2100 生物分析仪(Agilent2100expert_ HighSensitivityDNA Assay)。
 
1.3 方法
 
1.3.1 基因组 DNA 的提取 取肝癌模型小鼠的肝癌组织和癌旁组织以及河蟹幼蟹精巢组织,保存于事有稀释 DNA 溶液的离心管插入冰水中,并固定于固
 
定环中部的孔内。③初步设置超声破碎条件。本实验中使用的是 BILON92-IID 型超声波细胞粉碎机。
 
超声破碎条件的初步设置见表1。④进一步优化超声破碎条件。根据上一步的实验结果,对各种超声破碎条件做进一步的优化,见表2。
 
      1   初步设置的超声破碎条件      
               
                   
    超声功率     间隙时间/ 总工作时间   样品温度
( )   超声时间() ( )      
    W           s min      
150         /   5        
        28          
300         /   15   冰浴
        55        
450         /   30      
        73        
      2 进一步优化的超声破碎条件      
               
           
    超声功率 间隙时间/ 总工作时间 连续工作时间 样品温度
( ) 超声时间() ( ) (   )      
    W         s min min      
200     /     10   36      
  37          
240     /     14   54   冰浴
  46          
280     /     18   90      
  55          
  320     /     22   126      
  64          
1.3.3  基因组 DNA 破碎效果的分析 **先浓缩样
品。将以上超声波破碎后的 DNA 样品溶液用真空离心浓缩仪缩成原体积,用微量核酸蛋白分析仪测定其
浓度。 然后电泳分析。 取以上各种条件下破碎的 DNA 浓缩样品约0.2μg,用质量浓度为1.5%的琼脂
糖凝胶电进行检测。制胶时在冷却到约65 ℃ 的凝胶
 
溶液中加入 Gelred用于染色。电泳时间约35min,电压为8 V/cm。 电泳结果用凝胶成像系统 Chemidoc
 
XRS进行拍照、观察和分析。
 
1.3.4 (h)MeDIP 样品的制备和分析 在优化后的
 
超声波功率、间隔时间/超声时间,以及总超声时间条件下,使用超声波细胞粉碎机对各基因组 DNA 进行
超声波粉碎。用 DNA 甲基化**共沉淀试剂盒捕获各基因组甲基化 DNA 片段。所有操作步骤按照**共沉淀试剂盒使用说明书的操作流程进行。 然后将

 
                                  ( )           捕获的羟甲基化和甲基化 DNA 片段,用安
浸没在保存液中,离心管口用封口膜封口,大于 0.3 h MeDIP                              
捷伦 2100生物分析仪进行检测。                  
cm 厚度的样品保存前需要在冰上剪切成小于 0.3cm 2  结果                                          
的薄片。提取 DNA 时,分别取小于50 g的各组织, 2.1 优化的超声波破碎条件 超声波破碎 DNA
                    μ                                                      
用基因组 DNA 提取试剂盒,按照试剂盒使用说明书 验的初步结果表明 功率     间隙时间 超声时间
              ,用 Nano hotometer /               , 300 W、     , /      
的操作步骤提取基因组       总工作时间       效果**好     片段长度
              DNA               15min                    

    微量核酸蛋白分析仪测定其浓度。 p        
               
                 
Pearl                            
1.3.2 基因组 DNA 的超声波破碎 将各基因组
DNA 溶液分别加入 10ml 容量的离心管内,并加
                         
  2   稀释**溶液**终总体积为         100
ddH O             4.5 ml  ②    
  容量的烧杯,加入碎冰约达烧杯刻度的 90 ml 处,
ml                        
加适量水。在烧杯口放一个中部有孔的固定环,将盛
的峰值在 300bp 左右 波峰跨度在 90~1000bp。
                           
一步优化超声条件的实验结果表明,超声功率在240
~320 W 、间隙时间/超声时间 /       /   、总工
                      4s6s~5s5s  
作时间 12~20 min 都可以基本满足片段长度要求。
                      / 、总工
但超声功率 280 W 、间隙时间/超声时间      
                                  5s5s  
作时间18min效果**好(见图1、图2和图3)。    
是将电能转换为声能,后者使水(或其他液体)形成密
 
集的小气泡,随着气泡震动和其猛烈的聚爆而产生机械切割力,使被作用物破碎,DNA 等则被片段化[9-11]。超声波细胞粉碎机是各类生命科学和医学
 
实验室的常规仪器。 本研究中使用的是**产的 BILON92-IID 型超声波细胞粉碎机,虽然其变辐杆
 
直径有2mm、3mm、6mm、8mm、10mm、12mm 和15mm7种,但我们用的仪器的变辐杆直径是固定的
 
6mm。由于其直径相对较大,因此要求被处理的体积
 
较大。为了满足这一条件,我们将微克级 DNA 样本用ddH2O 稀释成满足仪器要求的足够量体积,在处理完成后再用普通的浓缩仪在4 ℃低温甚**室温下用大约20 min 的时间将其浓缩成原体积大小。为了减少浓缩时间,可以将4ml的 DNA 样品溶液分装到多个离心管中进行浓缩。 实验结果表明,低浓度溶液的 DNA 能被超声波细胞粉碎机很好地切割成预期长度的 DNA;超声破碎前后,DNA 溶液的浓度没有发生任何变化;而且室温和低温下短时间浓缩得到的 DNA 片段没有明显的质量差异。
 
在实验操作中,需要注意几个小问题:①在使用超声波细胞粉碎机处理 DNA 样品时,需要注意适时功率。因为在仪器工作的前3 min 内,其功率会有一定的波动,因此需要及时手动校正使其功率在设定的范围内。②超声处理过程中样品冰浴的问题。在我们的实验中,每一个样品的处理时间是18 min,在一个样品处理完成后,小烧杯内的冰块并没有完全融化,因此样品处理的整个过程都是在冰浴环境下进行的。但即使如此,在下一个样品处理前也需要重新换上新的冰块以确保接下来的样品处理的冰浴条件。③在离心管的选择上,我们用的是10ml容量的圆底透明离心管,变辐杆垂直悬于离心管中央,其游离端与管底相距约10mm,杆身与管四周内壁保持基本相等的距离。
 
综上所述,本文涉及的实验主要是 DNA (h)Me-DIP 和 DNA 样本文库制备前基因组 DNA 样本片段
 
化的问题。实验结果表明,利用超声波细胞粉碎机片段化基因组 DNA 在200~500bp之间的优化条件是超声功率280 W、间隙时间/超声时间5s/5s、总工作

时间18min,仪器连续工作时间不超过90 min,超声波处理时样品始终保持冰浴环境。以上优化的条件下可获得比较理想的片段,重复性好,技术和设备要求低、操作简单。