非机械细胞破碎方法和应用

许多有应用价值的产品如酶 、 蛋白质和高附加值的多不饱和脂肪酸等主要从微生物中获得, 而且大部分的微生物代谢产物是胞内物质, **破碎细胞壁才能释放这些物质用于提取分离,通过转换化学、物理和生物法、破碎细胞释放胞内代谢物。 工业上**常用的手段是机械破碎方法和非机械破碎方法, 机械破碎方法是依靠固体的剪切力(珠机)和液体剪切力(高压均质)等进行大规模的细胞破碎货超声波细胞粉碎机。 非机械方法细胞破碎技术具有反应条件温和、设备简单等优势,因此,在实际应用过程中,经常考虑酶活性水平、细胞破碎率和操作的可实现性等因素来选择适宜的方法。

非机械破碎的方法
 
化学渗透法,一些有机溶剂(如苯、甲苯)、 EDTA、表面活性剂
 
(Triton X-100,SDS)、改性剂(盐酸胍 、尿素)和抗生素等化学品都可以改变细胞壁或膜透性,而使细胞内含物渗透出来,这种方式称为化学渗透法。
 
机械渗透方法也称为渗透压冲击,这些细胞能适应慢慢改变细胞外的压强,但细胞外压力快速变化,则会物理性伤害细胞。先把细胞放在高浓度的蔗糖培养基中, 使细胞内压力和细胞外的压力平衡,然后急速稀释蔗糖培养基,它会导致细胞液压强上升而破坏细胞膜。 通常认为这种方法可使酶释放到细胞周质,或者**少释放到细胞表面。
 
酶溶法是使用酶改变细胞的渗透性,经常用于释放细胞周质或表面的酶。 通常用 EDTA 破坏革兰氏阴性细菌的细胞膜,溶酶可以影响细胞膜。 常用的溶酶有 β(1 - 6)和 β(1 - 3)葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白酶。
 
其他渗透技术,碱性蛋白质(如,鱼精蛋白、阳离子壳聚糖)可以通透酵母细胞。 而且,自然物质(例如,链球菌溶血素、病毒)可以通透动物细胞,电击还用于通透动物细胞,来研究细胞分泌物。
 
2 非机械破碎法的应用
 
刘建荣等以化学渗透法破碎重组大肠杆菌细胞, 释放重组超氧化物歧化酶(rhSOD)。 选择四个化学试剂(EDTA, Triton X - 100,SDS 和 NaOH)对 rhSOD 重组大肠杆菌细胞破碎实验,用 SDS - page 检测破碎的细菌的效果 , 结果 0.5% Triton X -100 和 10mmol/LEDTA 能更好地破碎重组大肠杆菌的细胞 , 所提取的包含体溶解液纯度与超声法相近。 Anand H 等采用 EDTA 促进大肠杆菌释放胞内蛋白,节约了大量的能源消耗。 这是因为革兰氏阴性细菌的细胞壁含有肽聚糖和一层脂多糖。 EDTA 为络合剂、使含金属离子的蛋白质具有水溶性,细胞破碎时,加入 EDTA
 
后可能破坏脂多糖结构的稳定性。 用 HG-HCl 和 Triton X-100
 
共同对大肠杆菌进行预处理, 也可以促进细胞膜和细胞壁中蛋白质的溶解作用。 β-葡聚糖酶与蛋白酶和磷酸甘露糖酶联合作用可以使酵母细胞壁内外两层一起破碎, 从而提高细胞破壁效应。 Trond S 等研究了混合酶(蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶)对红酵母细胞壁的破碎效果的影响,使虾青素产量增加 8%,较好地提高了红酵母的可利用性。 从细胞破碎的角度来说, 细胞壁坚硬,而细胞膜强度较差,易受渗透压的影响破碎,所以,破碎的阻力主要是细胞壁。 因此,细胞壁的结构和成分是非常重要的,而各种各样的微生物由于遗传和环境因素等因素不同, 导致细胞壁各不相同, 在细胞破碎过程中选择合适的化学试剂和酶是**重要的。
 

3 非机械破碎法的缺点
 
非 机械法破碎细胞后,因为只降解细胞壁的骨架 ,导致溶液中出现许多较大的碎块,会影响离心后细胞内含物的纯度。 此外,
 
在溶酶系统中,产物抑制是一个不可避免的问题,甘露糖会抑制蛋白酶的作用,葡聚糖会抑制葡聚糖酶的作用,因此,导致细胞内含物释放率低的一个**重要的因素可能是产物抑制。 此外,非机械方法的通用性差、 不同菌株需要选择相应的不同的化学试剂或酶,**好的解决方案条件难以确定。
 
3 展望
 
未 来的细胞破碎技术研究重点应放在对当前的知识的工
 
业 化、商品化应用上。 这需要释放率高、能耗低、方便后期提取这些方面综合考虑。 机械法和机械法结合可以有 “互补 ”的作用,大大提高破碎效率,可以使用化学、物理、酶三种组合破碎 ,
 
或者是使用化学、物理、酶先预处理,再进行机械细胞破碎仪破碎。 徐栋等曾采用高压匀质和蛋白酶法结合的方法破碎酵母细胞壁。高压均质可以初步破碎细胞壁结构, 消除酶和底物空间位阻, 从而促进蛋白酶水解细胞壁的蛋白质,获得尽可能多的小肽和氨基酸,提高产品的营养价值。 吴润娇采用高压均质酶解和温差破壁三种方法结合的破壁法制取啤酒废酵母味精, 在适当的条件下, 有时间短、提取率高、呈味物质肌苷酸、鸟苷酸溶出多的特点。 此外,在实际的破碎操作除了确保产品质量,也考虑其它副产品和菌渣等的可用性,以及后续提取的可操作性,进一步提高产品的附加值。