超声波细胞粉碎仪与佐剂性关节炎模型的建立

类风湿性关节炎(Rheumatoid A rthritis, RA)是一种常见的自身**性疾病, 以慢性、进行性、对称性及侵蚀性的外周关节的破坏为主要临床表现[ 1] 。 传统抗炎药疗效有限, 往往不能治愈, 是当今医学研究**域的热点之一。 RA 的动物模型有多种[ 2-5] , 弗氏完全佐剂诱导的大鼠佐剂性关节炎(A djuvant A r-thritis , A A)是**为经典、**为常用的 RA 实验模型之一, 目前**内一般都是通过从其后足垫皮内注射弗氏完全佐剂(F CA)进行诱导[ 5-8] 。 弗氏完全佐剂的制作方法有两种:一种是不用超声波细胞粉碎机;另一种是使用超声波细胞粉碎机。 为了比较两种方法的差异, 我们特做了大鼠试验, 结果发现:用了超声波细胞粉碎仪的大鼠模型成功率高, 而且模型更典型。

1 材料与方法

1 .1  动物雄性 Wistar 大鼠 24 只, 体重 l25g ~ 155g , 6~ 7 周龄。

中**中医骨伤科杂志 2008 年 1 月第 16 卷第 1 期
 
购自湖南中医药大学实验动物中心。 编号后随机分成 3 组.每组 8 只, 第 1 组为粉碎仪组即试验组, 第 2 组为非粉碎仪组即对照组, 第 3 组为空白组。 控制室温(24 ±2)℃, 湿度 55%及 Ft
 
照周期 8~ 20h 。
 
1 .2 仪器
 
口腔专业用 X 光牙片机(德**西门子公司产品);M icrom Series SA 一 300V 高压灭菌器;K S 一 250 超声波细胞粉碎仪
 
1 .3 试剂 液体石蜡(化学纯), 江苏鸿声化工厂(批号20020115);羊毛脂(化学纯), 中**上海华亭羊毛脂厂;冻干注射用灭毒卡介苗(BCG), 50 mg/ 瓶, 上海生物制品研究所(批号
 
000401, 010402 , 010609 , 020401)。
 
1 .4  方法  
1 .4.1  F CA 的浓度制备[ 5] 将液体石蜡和羊毛脂(2:1)于
70 ℃水浴中充分混匀, 高压灭菌(121 ℃、1.1kg/ cm 、30min), 制
 
成弗氏不完全佐剂(F IA), 4 ℃保存。 临用时, 将 BCG(用少量注射用水溶解)与 FIA 配成所需浓度(FCA 10mg/ ml), 振荡, 混
 
匀, 置 4 ℃冰箱保存备用。
 
1 .4.2  大鼠 A A 的诱导 临用前从冰箱取出 F CA , 充分振荡、
 
混匀, 对照组 8 只大鼠用 75 %乙醇消毒右足后, 于右足垫皮内直接注射未被乳化的 FCA 0.1m1 ;试验组则右足垫皮内注射用
 
超声波细胞粉碎仪乳化 FCA 20min, 成为 W/O 乳剂后的 FCA0 .1m1;而空白组 8 只大鼠则注射生理盐水 0 .1 ml。
 
1 .4.3 观察指标 自注射 FCA 后第 7 、l4、21 、28 、35 、42、49d ,
 
记录关节炎指数(A I)。 并从第 21d 起, 每隔 7 天引颈处死一组大鼠, 到第 49d 时同时处死所有大鼠, 取后肢关节立即作 X 线照片(电压 60 K V , 电流 7mA , 曝光时间 0 .04m s)并与放射科医生一起阅片并记录放射学指数(RI)[9] 。 另外观察注射局部有无感染及炎症反应。
 
1 .4.4 病理取材 透射电镜观察将处死后大鼠左侧眉窝部淋巴结和病变关节滑膜固定于 2 .5%戊二醛中, 常规透射电镜标本制备, 电镜观察。

2 结果
 
2 .1  大鼠 A A 模型的建立及不同时点 AI 观察
 
FCA 注射后所有大鼠局部注射部位均出现肿胀。 试验组
 
第 7d 时部分大鼠关节出现红肿, 第 10d75 %(6/ 8)的大鼠出现
 
关节红肿(A I >2), 第 l4 ~ 21d 87 .5%(7/8)的大鼠出现关节红肿(A I >2), 21d 达**高峰(A I =8 .9), 以后关节红肿逐渐减轻,
 
第 38d 基本恢复正常(A I =2 .1), 对照组第 7d 内大鼠未显示任
 
何关节红肿表现(A I =0), 第 10d 起部分大鼠关节出现红肿, 第 l4 ~ 18d 87 .5%(7/8)的大鼠出现关节红肿(A I >2), 第 28d 达
 
**高峰(A I =9 .6), 以后关节红肿逐渐减轻, 第 49d 基本恢复正常(A I =2.2)。 即 A I 随病程进展先升高后下降, 但试验组大鼠的关节红肿比对照组先发生, 且肿胀程度要轻。 空白组 8 只大鼠则在整个实验过程中均未出现关节红肿(AI =0)。
 
2 .2 从大鼠不同时点关节 X 线改变及 RI 观察 FCA 注射后第 2ld 时试验组和对照组大鼠关节除骨质疏
 
松外, 尚出现骨侵蚀(RI =3.0);第 28 **第 49d 后肢足垫 X 线片上可见有不同程度的骨质疏松、骨侵蚀、关节腔狭窄及远端趾骨形成(RI =8 .5)。 RI 随 FCA 注射后时间延长逐渐增高, 并且不随 AA 的病程而下降。 空白组大鼠的后肢足垫 X 线片未见上述改变。

2 .3 淋巴细胞电镜观察
 
两个处理组淋巴细胞形态基本正常, 细胞膜完整, 未见明显坏死。 但明显可见线粒体形态异常, 其基质密度降低, 线粒体嵴结构不清, 嵴断裂, 颗粒脱失, 细胞仪处理组尤为明显。 此外, 在淋巴细胞的胞浆内可见少量溶酶体(见图 1, 2)。
 
 
2 .4 滑膜电镜观察试验组:滑膜内层细胞坏死, 脱落, 细胞有时呈裸核。 内膜结构消失(基底膜、上皮细胞坏死, 溶解, 脱落)(图 3)示结缔组织层内胶原排列紊乱, 结缔组织内成纤维细胞核固缩, 有少量横纹可见(较非细胞仪组少见)。 对照组:滑膜内侧上皮侧脱落, 可见密集的细胞层(图 4-1)及走向较规则的胶原纤维, 但胶原纤维较正常组密度小。 部分节段上皮细胞及基底膜有残留(图 4-2), 可见生长正常的上皮细胞及成纤维细胞(图 4-3)。 空白组:可见腔面细胞(上皮), 基底膜(内膜)及其下的结缔组织层, 排列整齐, 细胞丰富, 结构层次清楚(图 5)。

 

3 讨论
 
1954 年 Stoerk **次成功在大鼠诱导 A A 后, 作为一种较为成熟的模型仍广泛用于 RA 的致病机理以及抗炎药物疗效的研究[ 10] 。 两种互不相容的液体, 借助别的物质而混合在一起, 叫做乳化。 超声波细胞粉碎器性能**, 其超声波换能器驱动电路将 50/ 60Hz 的市电转 2000HZ 的高频高压电能, 该能量被输到“ 高压电换能器” 中, 并被转换成高频机械震动, 再经 “ 变幅杆” 的聚能和振幅位移放大后作用于液体中而产生强大的压力波, 这个压力波则会形成千百万的微观气泡, 随着高频振动, 气泡将迅速增长, 然后突然闭合, 在气泡闭合时, 由于液体间相互碰撞产生强大的冲击波, 在其周围产生上千个大气压的压力(即超声乳化)。 它使得变幅杆顶部产生强有力的剪切活动, 并使得气体中的分子强力地被搅动。 该能量足以将细胞及各类无机物质破碎重组。 本仪器具有碎破组织、细菌、病毒、孢子及其它细胞结构, 匀质、乳化、 混合、脱气、崩散和分散、浸出和提取, 加速反映等功能, 故广泛应用于生物、医学、 化学、制药、食品、化妆品、环保等实验室研究及企业生产。 在弗氏不完全佐剂基础上, 加入灭活卡介苗溶液, 并通过超声波细胞粉碎仪制成 W/O 乳剂, 采取皮内注射, 目的是为延缓机体对 BCG 的吸收, 造成 BCG 对机体的不断刺激而产生继发的自身**应答反应;当再次接触抗原, 致敏 T 细胞分化增殖, 释放各种淋巴因子以及直接杀伤靶细胞, 引起单核细胞浸润 , 同时由抗原抗体形成的**复合物激活补体, 导致白细胞趋化激活, 释放一系列致炎因子产生局部和全身性炎症反应(称继发反应)。