专注于细胞破碎

对细胞生物学的重新兴趣已经产生了对于有效地破坏细胞外膜同时节省其内含物的技术的需要。

化学和机械方法是细胞裂解的两种一般方法,具有这些类别中的许多方法。BioSpec产品(Bartlesville,OK)**执行官Tim Hopkins博士说:“方法的选择取决于你想要从细胞中取出。

Bio-Rad实验室(Hercules,CA)将细胞破碎方法分类为温和或苛刻的。前者包括渗透裂解(悬浮细胞在高盐溶液中),冻融,去污剂和酶法。因为这些技术缓慢且相对低效,所以当分析敏感分子或细胞器时,它们提供一些防止过度加工的保护。粗略技术包括超声处理,法式压机,研磨,玻璃珠均化(珠磨)和共混型机械均质化。

化学裂解,有时与机械破碎结合,使用离液剂,去污剂和酶。大多数以套件提供。化学裂解是温和但不可预测的,因为破裂条件和持续时间可能在样品之间显着变化。机械系统涉及前期投资,而套件代表经常性费用。

来自Hielscher USA(Ringwood,NJ)的专门研究超声均化的文献表明,化学裂解可以改变蛋白质结构并引入纯化问题,而酶促破坏需要长的孵育时间并且不可再现。

机械技术

手动细胞破碎技术已经使用了几十年。虽然它们仍然是一些实验室的**,它们是低技术的,大多是未更新的与更现代的机械方法。一种方法包括冷冻细胞悬浮液并用研钵和研杵研磨该物质。冷冻研磨是缓慢,杂乱,难以缩放。其他方法在杵和样品容器壁之间或通过在高压下的小孔挤压细胞(French press)。这些方法不产生显着的热,但是缓慢和劳动强度。所有手动机械技术不适用于高通量操作。

超声波探头,转子 - 定子均化器和珠粒是更现代和流行的细胞工作的均质化方法。

以每秒20,000次循环操作的超声波探针在水溶液中产生空化 - 微小区域的真空样压力和高温,其将细胞分开。虽然温度可能达到几千摄氏度,但空化体积如此之小,它们不会显着加热过程。

假设样品和匀浆器之间的适当匹配,通过超声处理的细胞裂解花费几秒**两分钟。由于超声能量是用户在手持式和台式超声波仪上定义的,所以可以根据细胞和终产物来调整方法。例如,DNA提取需要“更软”的破坏,而来自细菌的蛋白质制备需要更严格的超声处理。

Hielscher建议在冷却的样品上使用长达15秒的短声波破裂循环,以允许热量消散,而对分析物没有不利影响。

Beadsbeating是由Hopkins在BioSpec完善的技术,摇动或涡旋密封在含有大量小球形珠(直径为0.1**6mm)的微小瓶或微孔板孔内的细胞样品,通常但不总是裂解溶液。高强度湿研磨工艺在不到三分钟内引起细胞膜或壁的渗透。Bebebeating非常适合高通量加工,也适用于小,完整的组织样本。

冷却操作

使用机械破碎和靶向蛋白质或细胞内超声波细胞粉碎机的实验室**密切注意操作温度。“理想情况下,你应该在加工过程中保持样品冰冷,”霍普金斯建议,但现实地,你可能会很好,如果温度不超过文化或组织源温度。

尽管**大努力保持样品冷,内源性酶可以破坏蛋白质,特别但不限于裂解和下游处理之间的时间,当细胞稳态不再存在,但酶活性持续。Bio-Rad提供了关于避免酶降解的以下建议:

  • 在强变性缓冲液(尿素,硫脲,洗涤剂)中裂解细胞。
  • 操作高于pH 9,其中蛋白酶活性**小化,使用碳酸钠或Tris作为缓冲剂。
  • 考虑向裂解缓冲液中加入化学蛋白酶抑制剂。为了获得**佳结果,在蛋白酶抑制剂混合物中使用抑制剂的组合。
  • 当研究蛋白质磷酸化时,包括磷酸酶抑制剂如冈田酸,钙调蛋白A和钒酸盐。
  • 细胞破碎后,通过光学显微镜检查细胞破碎的效率,离心所有提取物(20,000×g 15分钟,15°C),以去除不溶性物质。

有效中断的提示

另一种主要的机械破碎技术使用转子匀浆器。手持仪器通过在30,000rpm下在管内部转动的转子反复地迫使样品通过静态管的远端上的开口狭缝或孔来工作。转子 - 定子均化器快速工作并产生非常少的热量。在消极方面,它不是一种高通量的方法,可能与某些单细胞生物体工作不良。

样品破裂是从细胞和组织中分离RNA,DNA,蛋白质和超声波细胞粉碎机的必要的早期步骤。转子-定子匀浆器被广泛地用于此目的,因为它们机械地破坏细胞,而从降解不放过大分子。

PRO Scientific(Oxford,CT)销售总监Holly Yacko Archibald说:“均质化方法应该始终适合细胞或组织类型。动物和植物组织需要更严格的初始破碎方法,其后可能是较少机械剧烈的细胞破裂。Archibald补充说,许多培养细胞通过在合适的匀浆试剂存在下简单地涡旋其悬浮液而容易地裂解。

Archibald建议采购均质器的细胞破碎,以考虑血管和探头尺寸,变速控制和交叉污染回避。

探针/容器尺寸确定探针是否适合样品容器和/或提供足够的能量用于完全均质化。变速控制允许操作员从低功率升高到高功率,并再次返回,以避免产生样品不均匀性的口袋,并且它特别适合于超声波细胞粉碎机制备。

与使用通常使用一次性吸头的移液器相比,用转子匀化器更难以控制交叉污染。交叉污染导致分析物从一个样品携带到另一个样品; 例如,处理的细胞与未处理的细胞的匀浆。Multiprobe 均质器是提供多样性和自动化但增加成本的一种解决方案。替代方案是一次性探头或在运行之间清洁和消毒探头的老式方法。