酵母细胞的破碎及破碎率的测定浅谈

一.实验目的 
1. 掌握超声波破碎细胞的原理和操作 2. 学习细胞破碎率的评价方法 
二.实验原理 
频率超过15~20kHz的超声波,在较高输入功率下(100~250W)可破碎细胞。本实验采用JY95-2D超声波细胞粉碎机,其工作原理是:JY92-2D超声波细胞粉碎机由超声波发生器和换能器两部分组成。超声波发生器是将220W、500hz的单相电通过变频器件变为20~25Hz约600的交变电能,并用适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作,做纵向机械运动,震动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应,从而达到破碎细胞的目的。 
三.实验器材 
超声波细胞破碎机,电子显微镜,酒精灯,载玻片,血细胞计数版,接种针。 
四.试剂和材料 
(1)酵母细胞悬液0.2g/mL的啤酒酵母溶于50mol/L乙酸钠—乙酸缓冲溶液(Ph=4.7) 
(2)马铃薯培养基①马铃薯(去皮切块)200g ②琼脂20g ③蔗糖20g ④蒸馏水1000mL ⑤pH为6.5。 
 选取**马铃薯去皮切块,加水煮沸30mL,然后用纱布过滤,再加糖及琼脂,融化后补充加水**1000mL,分装,115℃灭菌20min。 
五.操作步骤 
(1)啤酒酵母的培养 
①菌种纯化。将酵母菌种转接**斜面培养基上,28~30℃,培养3~4d,培养成熟后,用接种环取一环酵母菌**80ml液体培养基中,28~30℃培养24h。 
②扩大培养。将培养成熟的8ml液体培养基中的酵母菌全部转接**80ml液体培养基的锥形瓶中28~30℃,培养15~20h。 (2)破碎前计数 取1ml酵母细胞悬液适当稀释后,用血细胞计数板在显微镜下计数。 
(3)细胞超声波破碎 
①将80ml酵母细胞悬液放入100ml容器中,液体浸没超声发射针1㎝。 ②打开开关,将频率设置中档,超声破碎1min,间歇1min破碎20次。 ③取1ml破碎后的细胞悬液经适当稀释后,滴一滴在血细胞计数板上,盖上盖玻片,用电子显微镜进行观察,计数。计算细胞破碎率。 
④破碎后的细胞悬液,于12000r/min 4℃离心30min,去除细胞碎片。用Lowry法检测上清液中蛋白质含量。 
六.结果与讨论 
1.用显微镜观察细胞破碎前后的形态变化。
 
 
2.用两种方法对细胞破碎率进行评价:一种是直接计数法,对破碎后的样品进行适当稀释后,通过在血球计数板上用显微镜观察来实现细胞计数,从而算出结果。另一种是间接计数法,将破碎后的细胞悬液离心分离掉固体,然后用用Lowry法检测上清液中蛋白质含量,也可以评估细胞的破碎程度。