超声波与高压破碎细胞介绍

**章 前言 
破碎细胞是制备胞内蛋白的必经途径,目前用于细胞破碎的方法主要有超声破碎法和高压破碎法。但迄今为止这两种破碎方法对目标蛋白的影响并没有一个明确的结论。 
超声破碎的机理涉及多种因素,包括空穴产生与复合伴随的高温(几千K)高压(几百个大气压)的变化、机械剪切力、气液界面的作用以及自由基的产生带来的理化效应[1]。超声可以使一些大分子降解、结构改变、形成聚集体以及化学键断裂等[2]。高压破碎的机理主要是由于样品流出时,细胞内外压力降低的速度不同,在膜两侧形成巨大压力差,使细胞膜破裂:出口处液体高速流动产生的剪切力也会导致细胞破裂[3]。高压处理还可用于乳化、制备脂质体以及降解高分子等
[4]
。 
己有报道对两种方法的差别进行了探讨。在制备β-内酰胺酶和氯霉素乙酰
基转移酶(CAT)时高压破碎效果要好。而在制备β-半乳糖苷酶和核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/加氧酶时,超声要优于高压破碎。 
第二章 常用的细胞破碎方法 
2.1细胞方法概述及其机理 
细胞膜将胞内包含物与环境分开,从而保证了细胞的完整性。细胞膜的弹性使细胞能够适应外界环境渗透压的急剧变化。在生命科学的研究中,通常要研究细胞内的大分子,如蛋白质、核算、酶等,所以**步就要设法将胞内的物质释放出来,这个过程叫细胞破碎或裂解(cell disruption or lysis)。破碎方法的好坏会影响到产率和产物的正确功能状态。破碎方法选择不正确还可能使目的蛋白降解,无法获得想要的蛋白。因此,破碎方法是开展工作的重要一步。目前常用的主要的细胞破碎技术如下。 
2.2机械法 
1.组织捣碎机;一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等,转速可高达10000rpm。以上。由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子如核酸则很少使用。 
2.匀浆器;匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离,破碎细胞的程度比组织捣碎机高。制作匀浆器的材料,除玻璃外,还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。 
3.研钵;多用于细菌或其他坚硬植物材料,研磨时常加入少量石英砂,玻璃粉或其他研磨剂,以提高研磨效果。 
4.细菌磨;是一种改良了的研磨器,比研钵具有更大的研磨面积,而且低部有出口。操作时先把细菌和研磨粉调成糊状,每次加入一小勺,研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎。 
2.3物理法 
主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。在生化制备中常用的方法有: 
1.反复冻溶法;先将样品深冷冻固,再缓慢的融化,反复多次,多用于动物性材料。 
2.急热骤冷法;将材料投入沸水中,维持85-90分钟,**水浴中急速冷却,此法可用于细菌及病毒材料。 
3.超声波处理;频率一般选在10KHz**200KHz,功率200-500瓦范围,处理时间有数分钟**数十分钟不等,处理过程中注意冷却。此法多用于微生物材料。 
4.高压破碎法;将细胞悬液增加到很高的压力,然后利用胞内压力变化比胞外慢而形成的压力差,将细胞破裂。 
2.4化学及生物化学法 
1.自溶法;在一定pH和适当的温度下,利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的方法。此过程需较长时间,常用少量防腐剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。 
2.酶溶法;利用各种水解酶,如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等,将细胞壁分解,使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感,加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后,使之转为对溶菌酶敏感而溶解。 
3.表面活性剂处理;如十二烷基硫酸钠、氯化十二烷基吡啶等。第三章 超声波及高压破碎 
3.1超声波破碎及其机理 
超声波破碎细胞是指一种利用大功率超声处理化细胞,使其细胞内物质释放的方法,其作用原理主要有两方面,水力作用和声化反应。水力作用是指大功率高频超声在液体介质中传播时使液体分子携带高能而运动,局部液体分子具有较高的能量,局部液体流动强烈。液体介质对细胞的剪切力增大。声化反应是指液体介质在一定强度的超声的作用下产生空化气泡,这些气泡在超声振荡的超声场中随着超声场的相位变化而长大和压缩。当空化气泡靠近细胞的表面处时,细胞表面上的空化气泡则发生不对称塌陷,产生直射向固体表面的射流束,对细胞产生强烈的冲击使细胞膜结构被破坏。同时,空化气泡在塌陷瞬时,局部可以产生高温高压,对细胞是一种强烈的破坏作用。 
新的研究对于超声破碎的机理提出了新的看法,有作者认为还有液体剪切力及自由基的贡献。影响破碎效率的因素也有很多,细胞浓度升高也会影响细胞的存活和自由基的产生。同时细胞浓度升高还会降低破碎效率,原因可能是每个细胞能接触微泡的机会减少[5]
。Miller的实验证实细胞越大破碎越容易。超声波的这些物理的、化学的和机械的作用不仅能使细胞膜破裂,同样也会对对目标分子产生不同的影响。 
3.2高压破碎 
压力破碎细胞(又称作高压均质)是使细胞内外的压力升高,然后当样品通过阀门流出,此时胞外的压力突然降**常压,而细胞内的压力相对于胞外压力降低的速度要慢得多,这样就在细胞膜的内外形成一个很高的压力差,在这个压力差的作用下,细胞膜破裂。实际上在这个过程中还涉及液体剪切力、空穴的产生与复合,以及样品流出时形成的湍流和冲击力等。而Shirgaonkar,I.Z.认为其中主要因素是空穴的产生与复合所产生的作用导致细胞的破裂[6]。Kleinig,A.R.则认为起主要作用的是惯性力的作用[7]。 
破碎效率主要与工作压力的大小、流速的快慢、细胞膜的强度以及细胞的形状有关[8]
。早在1979年Kelemen,M.V.就报道压力破碎的效率与细胞的形状和大小有关,棒状的比球形的易破碎,而大的比小的易破碎。即使同样是革兰氏阳性菌,相互之间的破碎条件可能要相差好几倍。 不同样品的压力破碎条件 有些细胞改变渗透压就能破碎(如动物细胞和一些细菌),有些动物细胞只要在2000psi (1psi=6.89Kpa,lkpa=0.145psi,lpsi表示1磅/方英寸)过一次,即可破碎好。而其它的细胞需要更大的强度(昆虫的血细胞需要15000psi;酵母需要20000psi;大肠杆菌也是用2000Upsi即可;而植物细胞需要40000psi)。 
3.3研究问题的由来 
为了理解高压破碎和超声破碎各自的有缺点,以指导正确使用两种破碎方法。通过对超声破碎和压力破碎进行的文来看。不同的作者得出的结论不同。 
两种破碎方法尽管原理不同,依然有很多相似之处,所以已经有人探索两者的差别。Mett,H.1988年就发现超声会使一种β-内酰胺酶的活力降低,而高压破碎对其活力没有影响。Vikha,I.V.在提取β-半乳糖苷酶时比较了超声、压力破碎等四种方法,认为超声效果**好。而Jorgensen,L.在比较超声和压力破碎释放大肠杆菌内蛋白氯霉素乙酰基转移酶(CAT)时,认为压力破碎的效率要高出很多。Mouget,J.L.发现高压破碎法提取的酶活力很低。 
从以上这些相互矛盾的研究工作中,我们很难知道这两种破碎方法之间的真正差别。为了进一步理解两种方法的差别,开展了两种方法的比较研究。 
前面的工作侧重从生物活力的角度去比较,先用两种方法破碎细胞,然后分离纯化或是直接测试目标分子的活力。这种方法的优点是能够反应出两种方法**终效果。对生物分子来说,结构和功能相适应,这种活力上的差别应该源自与结构的改变。所以本文从结构的角度研究两种破碎方法的差别,是一个全新的角度。有利于从机理上对两种方法的差别给出合理解释。 
第四章 高压破碎细胞与超声波破碎细胞的比较 
超声破碎法和高压破碎法都是高效的裂解细胞的方法。可以从以下几方面对两种方法进行比较。 
4.1样品处理速度 
如果是培养好的菌体直接用缓冲液悬浮,再来破碎的话,高压破碎处理的效率更高,速度更快。有些大肠杆菌,如果结合液氮冷冻处理,超声处理也能达到快速高效的目的。 
4.2操作技巧 
超声处理的破碎效率与超声波功率,是否融解有气体,探头位置的身前处理时间的长短,以及菌体的浓度都有很大的关系。但高压破碎对菌体浓度不感冒,只与设定的压力和样品流出的速度有关。所以压力破碎的重现性更好。**操作者的经验要求比较低。 
4.3样品体积 
两种破碎方法都可以处理几毫升以上的样品,但对于小体积样品,如几百微升的样品,高压破碎就无能为了。目前**小的高压破碎样品池也要求样品体积在一毫升以上。 
4.4样品降解 
由于两者破碎机理不同,目标蛋白的降解程度有很大的差别。超声由于是持续作用,而且处理过程中还会产生大量的自由基,并且会产生大量的热,因此,超声容易导致目标蛋白的降解。而压力破碎由于是瞬间作用,产热很少,而且热量也不容易积累,所以高压破碎处理样品时样品的降解要轻微的多。 
4.5目标蛋白的要求 
从机械破碎力上来看,高压破碎具有更强的机械破坏力。因此,对于分子量很大(100kD)以上的蛋白,往往高压破碎的效果比较差。在高压破碎出口初样品的流速可达1000m/s,而超声波处理时,能将部分分子加速到100m/s以上,但远低于高压出口处的流速,而且不是所有的分子,只是其中部分被加速,而高压破碎中所有样品都会被加速到很高的速度。这是两种方法机械破坏能力不同的原因。 
4.6应用范围 
两种方法除了可以用于破碎细菌外,均可用于脂质体制备,材料制备等方面。 
4.7样品的选择行 
高压破碎相对于超声破碎要更均匀一些,可以选择性的破坏细胞膜,从而来制备细胞核,而超声缺少这种选择性。另外,对不同的样品来说,两种方法获得的效果也不相同。例如,破碎酵母,超声难以获得满意的效果;而高压破碎可以利用与破碎大肠杆菌相同的条件裂解酵母,并能获得满意的效果。第五章 结论 
高压破碎应该是破碎细胞的**,如果目标分子很大,不能获得满意效果可以尝试超声破碎。超声只是作为特殊情况下的补充,如样品体积很小等。如果**用超声破碎,要注意,探头不可太浅,如果很浅,超声波能够使样品产生明显的漩涡,容易产生大量的气泡。目前实验室破碎用超声破频率为20kHz,在水中传播速度(20摄氏度)为1480m/s,波长约为7.4cm,共振长度为1.85cm,要避免超声波与样品产生共振。 
两种处理方法对目标分子造成损坏的机理不同。高压破碎是一个瞬间过程,样品高速流出时的剪切力对二级结构破坏较强,而超声破碎是一个持续过程,由于其热效应、企业界面的形成以及自由基的产生,会对目标分子产生多方面的影响,包括聚集、变性、降解等,作用机理相对复杂。 
无论是在细胞破碎还是乳化过程中,选择合适的处理方法要根据目标分子的大小、结构稳定性、是否含有二硫键等信息综合考虑。