浅谈细胞破碎--高压匀浆法

摘要:细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁,使细胞内容物包括目
的产物成分释放出来的技术,是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。目前已发展了多种细胞破碎方法,以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波等方法。本文主要介绍高压匀浆法,高压匀浆法的应用以及高压匀浆机的介绍和使用。 
**词:细胞破碎 高压匀浆法  高压匀浆机  影响因素  应用 
1、高压匀浆法破碎细胞原理 
高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法,作用机理是液体剪切作用,利用高压使细胞悬浮液通过针形阀,由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎,细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时,每秒速度高达几百米,高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上,被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化,从而造成细胞破碎。 
破碎属于一级反应速度过程,被破碎的细胞分率符合如下公式:                  ln[1/(1-R)]=KNPɑ           
式中  R — 破碎率,为N次循环后,蛋白质的释放量Rn与**大释放量Rm之比; 
  K - 与温度有关的速度常数;   N - 悬浮液通过匀浆器的次数;   P - 操作压力,MPa;   ɑ- 与微生物种类有关的常数。 
2、高压匀浆机 
2.1高压匀浆机工作原理及工作示意图 
高压匀浆器是常用的设备,它由可产生高压的正向排代泵和排出阀组成,排出阀具有狭窄的小孔,其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内,在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出,并射向撞击环上,由于突然减压和高速
2.2高压匀浆机性能特点 
凡与物料相接触的零部件材料都具有极高的耐磨性和良好的耐腐蚀性、对物料不会产生不良的影响,高压均质机与其它均质设备相比,具有占地面积小、效率高、能量大、反应时间快、运转费用低等优点。高压均质机品种、规格齐全,完全能满足各个**域用户的需要。均质功率从1KW-200KW,压力从15MPa-100MPa,从0.2升物料能做实验的台式小型均质机到3万升/小时超大型均质机,各种规格达一百多种,为全**同行业之**。机器的均质系统分别由一级阀和二级阀组成双级均质系统,两者的均质压力可以在其额定的压力范围内任意选择,两者可同时使用,也可单独使用。均质阀的结构可分为平型和W型两种,平型阀能承受高压冲击,具有耐磨性好、使用寿命长等优点。W型阀是一种能在一组阀件内产生多次均质过程结构的阀,大大的提高了其均质效果。泵休阀的结构分球型阀和碟型阀二种,球型具有耐高压、使用寿命长等优点。碟型具有结构简单、容积效率高等优点。  主要特点: 
(1)一级匀质阀,可选二级匀质阀  
(2)乳剂和脂质体研究生产单位中得到广泛使用。  
(3)意大利GEA Niro Soavi公司的高压匀浆机匀质阀材料为陶瓷,陶瓷阀的使用寿命是高密度硬质合金或碳化钨的使用寿命3 倍以上。(4)采用电机驱动,而非气动方式,避免了空气经压缩产生的水份进入高压泵,而导致高压匀浆机无法正常运行。  
(5)样品经高压匀浆后,**终平均粒径可以达到100 纳米以下,且粒径分布均匀。  
(6)可进行在线清洗(CIP )和在线蒸汽灭菌(SIP ),完全符合FDA要求。  (7)框架式系统按照ASME BPE标准装配。高压匀浆机按照ISO9001 质量体系标准生产。  
(8)可进行在位清洗和在线灭菌 技术参数: 
(1)**大工作压力1500 Bar—— 适合生物工程(酵母细胞破碎、大肠杆菌破碎、丝状真菌破碎、动物细胞及动物组织细胞破碎)、分子生物学、药剂、乳业、食品研发及中试等行业使用  (2)产量10L/hr  
(3)电源要求:三相电源,1.1KW /380V /50Hz /3phase  (4)尺寸(mm): W 460 x H 420 x L 800  (5)匀质阀材质:陶瓷  
(6)压缩头采用高质量、高强度和耐腐蚀的SAF2507特种双相不锈钢制造,能够在极高的操作压力稳定持久地工作,不会产生裂纹,有效抵抗腐蚀和机械损伤  (7)设备自重: 85 kg  
(8)按照ISO9001 质量体系标准生产 
3、影响高压匀浆法破碎细胞的主要因素[4] 
    本部分以高压匀浆破碎重组大肠杆菌为例子介绍影响高压匀浆法破碎细胞


去离子水悬浮,匀浆所得的rhIL-6纯度比用缓冲液A获得的rhIL-6纯度高出近十个百分点。这可能是因为在去离子水中,细胞内外的渗透压突然变化,细胞壁容易胀裂,在匀浆作用下更容易释放包含体另一方面在去离子水中,某些杂蛋白在匀浆作用下更容易裂解成小分子物质离心出去。 
4、高压匀浆法破碎细胞的应用 
4.1高压匀浆破碎螺旋藻细胞释放藻蛋白的研究 
螺旋藻是丝状的多细胞蓝藻,因含有多种对人体有益的营养物质而受到广泛的关注[1]
。螺旋藻可通过大面积的海水养殖而得,其含量丰富的藻蛋白(藻胆蛋白藻蓝蛋白),在化妆品制造业、食品加工等行业中有着巨大的应用潜力,近期的研究还发现藻蛋白对某些疾病有治疗作用。从海藻中提取分离藻胆蛋白目前仍是获得藻胆蛋白的主要途径,由于藻蛋白为螺旋藻的胞内产物,因此,提取纯化藻蛋白采用何种细胞破碎技术是直接影响蛋白提取率的**因素之一。目前用于螺旋藻藻蛋白提取分离过程中的细胞破碎方法主要有超声波破碎法、高压匀浆法、反复冻融法、酶溶法和化学试剂法[5]等。但由于超声破碎,反复冻融,酶融法只适用于实验室中小规模的细胞破碎,在某种程度上限制了螺旋藻藻蛋白的大规模分离纯化。高压匀浆法是工业上常用的细胞破碎的方法。采用高压匀浆法破碎螺旋藻进行细胞破碎,释放藻蛋白过程中的物理和化学因素,包括均浆次数、均浆压力、藻细胞密度、缓冲液pH 值、悬浮液体系等进行系统研究,并结合该过程的动力学规律,初步确定了大规模破碎螺旋藻细胞,提取藻蛋白的匀浆工艺,为螺旋藻蛋白工业化生产奠定基础。 
在螺旋藻蛋白产品的生产由实验室规模扩大到中试规模的过程中,藻细胞的大规模破碎是**的。只有高压匀浆破碎或珠磨法才能满足产业化的要求。经过多次实验在考察了高压匀浆对破碎细胞过程的各种影响因素后初步得出高压匀浆破碎螺旋藻细胞的工艺为:进料藻液密度为150g/L 左右,用磷酸缓冲液悬浮,在80MPa压力下连续高压匀浆三次,每次通过匀浆机的裂解液用冰浴冷却使得匀浆器出口温度不超过40℃。经过这样的破碎可得到86% 的藻细胞破碎率和73% 的藻蛋白含量。2.6 高压匀浆破碎螺旋藻细胞动力学分析高压匀浆破碎动力学方程为ln[1/(1-D)]=KNbpa[6],式中,D 为细胞破碎率;N 为匀浆次数;p 为匀浆压力;K、b、a 为匀浆过程参数;N=1 时以ln[1/1 - D]对压力p 取双对数作图得一直线,由直线斜率可得出压力指数a ,由直线截距可得K ,再作D 与匀浆次数N 、匀浆压力p 的关联图,用**小二乘回归可求得参数b。 
4.2高压匀浆破碎释放重组大肠杆菌提取包含体过程的研究[4]4.2.1 高压匀浆破碎工艺的初步确定 
在基因工程药物的生产由实验室规模扩大到中试规模中,大规模破碎重组大肠杆菌细胞**用匀浆破碎或珠磨法才能满足产业化的要求。经过多次试验,在考察了高压匀浆对破碎细胞过程的各种影响因素后初步得出高压匀浆破碎含有rhIL-6包含体的重组大肠杆菌细胞的工艺:菌体浓度150g×L-1左右(目标蛋白表达量为20%) 用去离子水悬浮,在80MPa压力下,连续高压匀浆三次 每次通过匀浆机的裂解液用冰浴冷却 使得匀浆器出口温度不超过40°C 经过这样的破碎,表达量为20%的菌种可得到纯度为40%的包含体。 4.2.2 高压匀浆破碎重组大肠杆菌动力学分析 
    Middelberg[5]建立了大肠杆菌高压匀浆破碎动力学方程 ln[1/(1-D)]=KNbpa,其中D为细胞破碎率,N为匀浆次数,p为匀浆压力, K、 b、 a 、为匀浆过程参数。N=1时,以ln[1/1-D] 对压力p 取双对数作图,得一直线,由直线斜率可得出压力指数a,由直线截距可得K。再作D与匀浆次数N,匀浆压力p 的关联图,用**小二乘回归可求得参数b。下表表为改变高压匀浆过程中压力、温度、浓度、pH及悬浮体系得出的动力学参数总结表。 
    从表可知,重组大肠杆菌细胞高压匀浆破碎的压力指数a为1.032>1 小于文献报道的酵母细胞匀浆压力指数2.9,未重组大肠杆菌细胞压力指数2.2[6] ,这说明经诱导的重组大肠杆菌细胞更易破碎,对参数b影响较大的是菌体的悬浮体系 参数k受压力影响**大

高压匀浆法操作参数少,且易于确定;且样品损失量少,在间歇处理少量样品方面效果好,在实验室和工业生产中都已得到应用,适用于酵母和大多数细胞的破碎。对于易造成堵塞的团状或丝状真菌以及一些易损伤匀浆阀,质地坚硬的亚细胞器一般不适用。