超声波破碎细胞浅谈

摘要:细胞破碎是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁,使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术,是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。结合重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展,以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。    但是由于细菌、酵母、真菌、植物细胞壁的组成成分不同,且同类细胞结成的网状结构也不同,所以其细胞壁的坚固程度不同。而动物细胞虽没有细胞壁,但具有细胞膜,也需要一定的细胞破碎方法来破膜,达到提取产物的目的。  
**词:细胞破碎;超声波机理;仪器应用;优缺点 正文 
一、细胞破碎方法 1. 机械法   1.1 组织捣碎 
  将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨****慢处,开动开关后,逐步加速**所需速度。一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等,转速可高达10000rpm/M以上。由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子如核酸则很少使用。( C# j5 _- l" ]7 J+ [8 k& Z( d 1.2 匀浆器 + ~. v9 ]0 @+ p' D: V 
  先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎。匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。制作匀浆器的材料,除玻璃外,还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。存在的问题;较易造成堵塞的团状或丝状真菌,较小的革兰氏阳性**以及有些亚细胞器,质地坚硬,易损伤匀浆阀,也不适合用该法处理。 1.3 研钵 
多用于细菌或其他坚硬植物材料,研磨时常加入少量石英砂,玻璃粉或其他研磨剂,以提高研磨效果。 1.4 细菌磨 
是一种改良了的研磨器,比研钵具有更大的研磨面积,而且低部有出口。操作时先把细菌和研磨粉调成糊状,每次加入一小勺,研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎。 2. 化学及生物化学法 2.1自溶法 
  在一定PH和适当的温度下,利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的方法。此过程需较长时间,常用少量防腐剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。 2.2 酶溶法1 e8 ~# a2 N/ T; L 
  利用各种水解酶,如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等,将细胞壁分解,使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感,加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后,使之转为对溶菌酶敏感而溶解。  2.3 化学渗透法   
  某些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理;化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。   3. 物理法   3.1 反复冻溶法  
  原理:因突然冷冻,细胞内冰晶的形成及  胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。 方法:将待破碎的细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。   3.2 急热骤冷法 6 S) q& X, q" g  ^! h/ I 
   将材料投入沸水中,维持85-90分钟,**水浴中急速冷却,此法可用于细菌及病毒材料。 
二、超声波破碎机理 
    超声波是物质介质中的一种弹性机械波,它是一种波动形式,因此它可以用于探测人体的生理及病理信息,既诊断超声。同时,它又是一种能量形式,当达到一定剂量的超声在生物体内传播时,通过它们之间的相互作用,能引起生物体的功能和结构发生变化,即超声生物效应。超声对细胞的作用主要有热效应,空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时,摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动,使部分能量转化为局部高热(42-43℃),因为正常组织的临界致死温度为45.7℃,而**组织比正常组织敏感性高,故在此温度下**细胞的代谢发生障碍,DNA、RNA、蛋白质合成受到影响,从而杀伤癌细胞而正常组织不受影响。空化效应是在超声照射下,生物体内形成空泡,随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡,使**出血、组织瓦解以致坏死。另外,空化泡破裂时产生瞬时高温(约5000℃)、高压(可达500×104Pa),可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子,由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应,超声波在传播过程中介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化,引起细胞结构损伤。杀伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相关。 
三、超声波应用 
   1、超声波提取生物纳米(超声波化学合成法)超声波化学反应中,起**作用的是声波的空化效应,在超声波的辐照过程中,在液体里将发生空化气泡的形成,长大和崩灭,当空化气泡崩灭时产生一个覆盖着的强压力脉冲,产生许多独特的性质,例如产生高达5000K的高温,大于200Mpa的压力,这就是超声波化学合成的能量来源,利用这些能量能在一些特殊粉末表面合成出纳米粒子。   2、超声波制药  
   2.1注射用医药物质的分散——将磷脂类与胆固醇混合用适当方法与药物混合在水液中,经超声分散,可以得到更小粒子供静脉注射。 
    2.2草药提取——利用超声分散破坏植物组织,加速溶剂穿透组织作用,提高中草药有效成分提取率。如金鸡纳树皮中全部生物碱用一般方法侵出需5小时以上,采用超声分散只要半小时即可完成。 
    2.3制备混悬剂——在超声空化和强烈搅拌下,将一种固体药物分散在含有表面活性剂的水溶液中,可以形成1um左右口服或静脉注射混悬剂。例“静注喜树碱混悬剂”“肝脏造影剂”、“硫酸钡混悬剂”。 
    2.4 制备疫苗——将细胞或病菌借助于超声分散将其杀死以后,再用适当方法制成疫苗。 
3、超声波对化妆品的分散 
    为了更进一步提取药物精华和粒子微细化,并节约生产成本,达到分散、乳化效果,使化妆品更深入渗透到肌肤里层,让肌肤很好的吸收,发挥药物的效力和作用,采用超声波乳化可达到非常理想的效果。采用超声分散,则不需要使用乳化剂,就能使蜡及石蜡乳化、化妆水等油的微粒子分散。石腊在水中分散的粒子直径可达1um以下。 4、超声波对酒的醇化—催陈技术 
    一瓶美酒以它的酒味醇厚,绵软柔和、芳香浓郁为人青睐,人们常用陈年老酒来形容酒的珍贵,一瓶上世纪的陈酒,标价几万元,其价格的含义在于时间的存放上。酒的主要控制因素是化学变化即酸的形成,并进一步酯化,酯参与乙醇和水的缔合。刚出厂的酒含有戍醇,有辛辣味,这种气味要经过很长时间才能化解,这个缓慢变化称酒的醇化。用功率1.6KW,频率17.5-22KHZ的超声波处理5-10min,可使酒的老熟时间缩短1/3到1/2。 
四、超声波破碎技术的优缺点 
就目前超声波仪器主要有超声波振荡器以及超声波粉碎机等。其优点是保持细胞活性,省时,样品损失少,可以处理大量样品。因此超声波细胞粉碎机的不断发展和改进,对大规模生产的贡献是十分可观的。 超声波细胞粉碎机进行超声粉碎破碎是目前在生物生产中**常用的破碎方法。对不同菌种的发酵液。超声破碎的效果差别较大。一般地,杆菌比球菌较易破碎,革兰氏阴性细菌细胞比革兰氏阳性细菌细胞较易破碎,对酵母菌的效果较差。优点:操作简便,液量损失少,适合实验室规模。缺点:成本高;易引起温度的剧烈上升;在大规模操作中,声能传递和散热困难,产生的化学自由基团易使产物失活,所以其影响了其在大规模的工业上的应用。 
五、总结 
     超声波细胞粉碎机可以并且已经被广泛用于生物化学、微生物学药理学、物理学、动物学、农学、医学、制药等**域的教学、科研、生产 
    超声波破碎作为细胞破碎的一种方法在实验室规模应用较普遍,处理少量样品时操作简便,液量损失少,但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递,散热均有困难,应采取相应降温措施。从前面可以看出超声波破碎细胞技术远未完善,还有待进一步发展。