细胞破碎技术——超声波破碎法浅谈

摘要:细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁,使细胞内容物包括目
的产物成分释放出来的技术,是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质的基础。细胞破碎就是采用一定的方法,在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜,设法使胞内产物**大程度的释放到液相中,破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后,再采用不同的分离手段进一步纯化。 
 
**词:细胞破碎;超声波;细胞悬浮液;超声振荡器 
 
正文: 
一、细胞破碎的综述 
除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外,对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化,都需要事先将细胞和组织破碎,使生物大分子充分释放到溶液中,并不丢失生物活性。 
要分离和提取这些产物,则需**先收集菌体,进行细胞破碎,使代谢产物转入液相中。然后,再进行细胞碎片的分离,破碎细胞是为了破坏细胞的外壳,使细胞内含物有效地释放出来,获得有效的提取。 
    细胞外壳,如微生物通常包括细胞壁和细胞膜,其中细胞膜主要由蛋白质和类脂质组成,使细胞内外保持一定的浓度差,对渗透压冲击比较敏感,所以比较容易破碎。各类微生物的细胞壁其组成是不相同的,但主要成分是多糖类物质,还含少量的蛋白质或脂类。细胞破坏的主要阻一力来自于细胞壁的多糖类物质聚合的网状结构和它的厚度,即主要阻力是网状结构的共价键。动物细胞没有细胞壁,很容易破碎。[1] 
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜,使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术,是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展,以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。 
    基于遗传和环境等因素,不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同,故细胞壁的机械强度不同,细胞破碎的难易程度也就不同。此外,不同的生化物质其稳定性有较大差别,在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。因此,破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。
【1】
 
 
二、超声波细胞破碎法 
超声波是物质介质中的一种弹性机械波,它是一种波动形式,因此它可以用于探测人体的生理及病理信息,既诊断超声。同时,它又是一种能量形式,当达到一定剂量的超声在生物体内传播时,通过它们之间的相互作用,能引起生物体的功能和结构发生变化,即超声生物效应。超声对细胞的作用主要有热效应,空化效应和机械效应。超声波破碎法是利用超声波振荡器发射15~25 kHz的超声波来处理细胞悬浮液,从而使细胞破碎。超声波振荡器有不同的类型,常用的为电声型,它是由发声器和换能器组成,发生器能产生高频电流,换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器又可分为槽式和探头直接插入介质两种型式,一般破碎效果后者比前者好。 
    超声波破碎细胞,其机理可能与液体中空穴的形成有关。当超声波在液体中.传播时,液体中的某一小区域交替重复地产生巨大的压力和拉力。由于拉力的作用,使液体拉伸而破裂,从而出现细小的空穴。这种空穴泡在超声波的继续作用下,又迅速闭合,产生一个极为强烈的冲击波压力,由它引起的黏滞性漩涡在悬浮细胞上造成了剪切应力,促使其内部液体发生流动,而使细胞破碎。     超声波处理细胞悬浮液时,破碎作用受许多因素的影响,如超声波的声强、频率、液体的温度、压强和处理时间等,此外介质的离子强度、pH和菌种的性质等也有很大的影响。不同的菌种,用超声波处理的效果也不同,杆菌比球菌易破碎,革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌易破碎,酵母菌效果较差。细菌和酵母菌悬浮液用超声波处理时,时问宜长点。  
使用超声破碎**注意的是控制强度在一定限度,即刚好低于溶液产生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致某些活性物质失活。过低的强度将降低破碎效率。**好在正式实验前用多余样品试超,调校超声波发生器在稍低于产生泡沫的强度。正式超声波破碎样品时强度只能在预定位置附近做微小调整。 
   超声波破碎的优点是在处理少量样品时操作简便,液量损失少。其缺点是超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质变性失活,噪声令人难以忍受,大容量装置声能传递、散热均有困难。为了防止电器长时间运转产生过多的热量,常采用问歇处理和在冰水或有外部冷却的容器中进行。因此,主要用于实验室规模的细胞破碎。此法多适用于微生物材料和脑组织匀浆。对超声波敏感的酶和核酸应慎用。 
(一)、超声波破碎仪器 
超声波细胞破碎仪又名超声微波协同萃取仪,超声波细胞裂解仪,超声波纳
米材料粉碎机。  
超声波细胞破碎仪的原理并不是太神秘、太复杂。简单说就是将电能通过换能器转换为声能,这种能量通过液体介质而变成一个个密集的小气泡,这些小气泡迅速炸裂,产生的象小炸弹一样的能量,从而起到破碎细胞等物质的作用。 
超声波细胞破碎仪具有破碎组织、细菌、病毒、孢子及其它细胞结构,匀质、乳化、混合、脱气、崩解和分散、浸出和提取,加速反应等功能,故广泛应用于生物、医学、化学、制药、食品、化妆品、环保等实验室研究及企业生产。 
超声波细胞破碎仪由超声波发生器和换能器两大部分组成(有的配置有隔音箱)。 
(1)超声波发生器:由信号发生器来产生一个特定频率的信号,这个特定频率就是换能器的频率,一般应用在超声波设备中的超声波频率为20KHz、25KHz、28KHz、33KHz、40KHz、60KHz。  
(2)换能器组件:主要由换能器和变幅杆组成。  
(3)隔音箱:可以有效地的降低工作过程中的所发出的噪音,保持实验室安静 
(二)、超声波仪器实验注意事项 
1 、切记空载(一定要将超声变幅杆插入样品后才能开机)。 
2、变幅杆(超声探头)入水深度: 1.5Cm左右,液面高度**好有30mm以上,探头要居中,不要贴壁。超声波是垂直纵波,插入太深不容易形成对流,影响破碎效率。 
3、超声参数设置:设置键好仪器工作参数,对于对温度要求比较敏感的样品(比如细菌)一般外面采用冰浴,实际温度肯定是低于25度,蛋白核酸肯定不会变性。 (1)时间:超声时间每次**好不要超过5秒,间隙时间应大于或等于超声时间,以便于热量散发。时间设定应以超声时间短,超声次数多原则,可延长超声机子以及探头的寿命。 
(2)超声功率:不宜太大,以免样品飞溅或起泡沫,如小于10ml样品容量,功率应在200w以内,选用2mm超声探头,另将面板后面的变幅杆选择开关打到相应挡;10-200ml样品容量的功率在200-400w,选用6mm超声探头,另将面板后面的变幅杆打到相应挡;200ml以上的样品容量功率在300-600w之间,选用10mm超声探头,另将面板后面的变幅杆打到相应挡;(2MM的小探头功率严禁超过350W)。 (3) 容器选择:有多少的样品就选多大的烧杯,这样也是有利样品在超声中对流,提高破碎效率。例如;20mL的处理量**好用20mL的烧杯。如100ml大肠杆菌样品设置参数:超声5秒 /间隙5秒次数70次(总时间为10分钟)。功率300W(仅供参考),500ML左右的量,功率开到500W-800W左右 
4、若样品放在1.5ml的EP管里请一定要将EP管固定好,以防冰浴融化后液面下降导致空载 
5、日常保养:用完后用酒精擦洗探头或用清水进行超声。
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三、超声波处理  
用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用
于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,频高于15~20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。其破碎机理:可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及**种类型等因素有关。 
 超声波是物质介质中的一种弹性机械波,它是一种波动形式,因此它可
以用于探测人体的生理及病理信息,既诊断超声。同时,它又是一种能量形式,当达到一定剂量的超声在生物体内传播时,通过它们之间的相互作用.超声波是物质介质中的一种弹性机械波,它是一种波动形式,因此它可以用于探测人体的生理及病理信息,既诊断超声。同时,它又是一种能量形式,当达到一定剂量的超声在生物体内传播时,通过它们之间的相互作用,能引起生物体的功能和结构发生变化,即超声生物效应。超声对细胞的作用主要有热效应,空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时,摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动,使部分能量转化为局部高热(42-43℃),因为正常组织的临界致死温度为45.7℃,而**组织比正常组织敏感性高,故在此温度下**细胞的代谢发生障碍,DNA、RNA、蛋白质合成受到影响,从而杀伤癌细胞而正常组织不受影响。空化效应是在超声照射下,生物体内形成空泡,随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡,使**出血、组织瓦解以致坏死。另外,空化泡破裂时产生瞬时高温(约5000℃)、高压(可达500×104Pa),可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子,由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应,超声波在传播过程中介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化,引起细胞结构损伤。杀伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相关。 超声波细胞破碎仪的原理并不是太神秘、太复杂。简单说就是将电能通过换能器转换为声能,这种能量通过液体介质(如水)而变成一个个密集的小气泡,这些小气泡迅速炸裂,产生的象小炸弹一样的能量,从而起到破碎细胞等物质的作用。 
超声波细胞粉碎机是利用一种超声波在液体中产生空化效应的多功能、多用途的仪器;它能用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎,也可用于各类无机物质的破碎重组,同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消泡清洗及加速化学反应等。超声波细胞粉碎机有广泛的用途,如: 
    1、超声波提取生物纳米(超声波化学合成法)超声波化学反应中,起**作用的是声波的空化效应,在超声波的辐照过程中,在液体里将发生空化气泡的形成,长大和崩灭,当空化气泡崩灭时产生一个覆盖着的强压力脉冲,产生许多独特的性质,例如产生高达5000K的高温,大于200Mpa的压力,这就是超声波化学合成的能量来源,利用这些能量能在一些特殊粉末表面合成出纳米粒子。     2、超声波制药  
(1)注射用医药物质的分散——将磷脂类与胆固醇混合用适当方法与药物混合在水溶液中,经超声分散,可以得到更小粒子供静脉注射。 
    (2)草药提取——利用超声分散破坏植物组织,加速溶剂穿透组织作用,提高中草药有效成分提取率。如金鸡纳树皮中全部生物碱用一般方法侵出需5小时以上,采用超声分散只要半小时即可完成。 
    (3)制备混悬剂——在超声空化和强烈搅拌下,将一种固体药物分散在含有表面活性剂的水溶液中,可以形成1um左右口服或静脉注射混悬剂。例“静注喜树碱混悬剂”“肝脏造影剂”、“硫酸钡混悬剂”。 
    (4) 制备疫苗——将细胞或病菌借助于超声分散将其杀死以后,再用适当方法制成疫苗。【5】 
    3、超声波对化妆品的分散 
    为了更进一步提取药物精华和粒子微细化,并节约生产成本,达到分散、乳化效果,使化妆品更深入渗透到肌肤里层,让肌肤很好的吸收,发挥药物的效力和作用,采用超声波乳化可达到非常理想的效果。采用超声分散,则不需要使用乳化剂,就能使蜡及石蜡乳化、化妆水等油的微粒子分散。石腊在水中分散的粒子直径可达1um以下。 
    4、超声波对酒的醇化—催陈技术 
    一瓶美酒以它的酒味醇厚,绵软柔和、芳香浓郁为人青睐,人们常用陈年老酒来形容酒的珍贵,一瓶上世纪的陈酒,标价几万元,其价格的含义在于时间的存放上。酒的主要控制因素是化学变化即酸的形成,并进一步酯化,酯参与乙醇和水的缔合。刚出厂的酒含有戍醇,有辛辣味,这种气味要经过很长时间才能化解,这个缓慢变化称酒的醇化。用功率1.6KW,频率17.5-22KHZ的超声波处理5-10min,可使酒的老熟时间缩短1/3到1/2。 
    因此超声波细胞粉碎机可以并且已经被广泛用于生物化学、微生物学药理学、物理学、动物学、农学、医学、制药等**域的教学、科研、生产。【3】
 
 
超声波破碎作为细胞破碎的一种方法在实验室规模应用较普遍,处理少
量样品时操作简便,液量损失少,但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递,散热均有困难,应采取相应降
温措施。从前面可以看出超声波破碎细胞技术远未完善,还有待进一步发展。
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