细胞破碎浅谈

摘要:细胞破碎,细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁,使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时,**先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织,其细胞破碎的难易不一,使用的方法也不相同,如动物脏器的细胞膜较脆弱,容易破碎,植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁 
细胞破碎方法有:高压匀浆破碎法      振荡珠击破碎法        高速搅拌珠研磨破碎法      超声波破碎法        渗透压冲击破碎法    酶溶破碎法等等,这篇综述主要讲的是超声波破碎法。 
**词:细胞破碎          超声波破碎法      原理        应用 
超声波细胞破碎仪又叫超声波细胞粉碎仪是一种利用强超声在液体中产生空化效应,对物质进行超声处理的多功能、多用途的仪器。能用于多种动植物细胞、病毒细胞的破碎,同时超声波细胞破碎仪可用来乳化、分离、匀化、提取、消泡、清洗及加速化学反应等。 仪器原理: 
超声波细胞破碎仪的原理并不是太神秘、太复杂。简单说就是将电能通过换能器转换为声能,这种能量通过液体介质而变成一个个密集的小气泡,这些小气泡迅速炸裂,产生的象小炸弹一样的能量,从而起到破碎细胞等物质的作用。 超声波是物质介质中的一种弹性机械波,它是一种波动形式,因此它可以用于探测人体的生理及病理信息,既诊断超声。同时,它又是一种能量形式,当达到一定剂量的超声在生物体内传播时,通过它们之间的相互作用,能引起生物体的功能和结构发生变化,即超声生物效应。超声对细胞的作用主要有热效应,空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时,摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动,使部分能量转化为局部高热(42-43℃),因为正常组织的临界致死温度为45.7℃,而**组织比正常组织敏感性高,故在此温度下**细胞的代谢发生障碍,DNA、RNA、蛋白质合成受到影响,从而杀伤癌细胞而正常组织不受影响。空化效应是在超声照射下,生物体内形成空泡,随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡,使**出血、组织瓦解以致坏死。另外,空化泡破裂时产生瞬时高温(约5000℃)、高压(可达500×104Pa),可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子,由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应,超声波在传播过程中介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化,引起细胞结构损伤。杀伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相关。 结构特点: 
●超声探头采用进口钛合金材质 ●高能效换能器 结构图片[1] 
●振幅自动调节,在不同的负载状况时振幅保持一致 ●设置超声间歇时间
●微机控制,超声功率连续调节 ●集成温度控制样品温度 ●隔音箱均采用特殊隔音材料 技术参数: 
工作频率范围:20~25KHz。频率自动跟踪。 
超声波细胞破碎仪可储存十套常规程序数据和一套组合程序,工作方式有定时和计数两种。 
组合程序**多可以由十套常规程序组成,可选择循环或不循环工作模式。 超温保护及报警功能。 
超声波输出强度自动限定功能。 
定时方式工作时间定时:0~99小时59分59秒。 计数方式超声工作次数:0~9999次。 超声时间范围:0~99小时59分59秒。 
间隙时间范围:0~99小时59分59秒。间隙时间=0为超声连续工作。 功率调整范围:额定功率的0~99%。 温度设定范围:0~99℃。 时间控制精度:1S±0.1‰。 温度控制精度:±1℃。 
工作电压:VAC100-240,50-60Hz。 
工作环境:室内(无潮湿,无阳光直射,无腐蚀性气体 主要用途: 
超声波细胞破碎仪具有破碎组织、细菌、病毒、孢子及其它细胞结构,匀质、乳化、混合、脱气、崩解和分散、浸出和提取,加速反应等功能,故广泛应用于生物、医学、化学、制药、食品、化妆品、环保等实验室研究及企业生产。  
一、细胞破碎阻力 
细菌—— 几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖(peptidoglycan)组成,它是难溶性的聚糖链(glycan chain),借助短肽交联而成的网状结构,包围在细胞周围,使细胞具有一定的形状和强度。短肽一般由四或五个胺基酸组成,如L-丙氨醯-D-谷氨醯-L-赖氨醯-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-胺基酸与二氨基庚二酸存在。 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构,其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度,如果交联程度大,则网结构就致密。 
酵母菌——酵母细胞壁的**里层是由葡聚糖的细纤维组成,它构成了细胞壁的刚性骨架,使细胞具有一定的形状,覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白,**外层是甘露聚糖,由1,6一磷酸二酯键共价连接,形成网状结构。在该层的内部,有甘露聚糖-酶的复合物,它可以共价连接到网状结构上,也可以不连接。与细菌细胞壁一样,破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。  真菌——霉菌的细胞壁主要存在三种聚合物,葡聚糖(主要以β-1,3糖苷键连接,某些以β-1,6糖苷键连接),几丁质(以微纤维状态存在)以及糖蛋白。**外层是α-和β-葡聚糖的混合物,第2层是糖蛋白的网状结构,葡聚糖与糖蛋白结合起来,第3层主要是蛋白质,**内层主要是几丁质,几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。与酵母和细菌的细胞壁一样,真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关,不仅如此,它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构,所以强度有所提高。
植物细胞——对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。 初生壁是细胞生长期形成的。 次生壁是细胞停止生长后,在初生壁内部形成的结构。 目前,较流行的初生细胞壁结构是由Lampert等人提出的“经纬”模型,依据这一模型,纤维素的微纤丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上面,同一层次上的微纤丝平行排列,而不同层次上则排列方向不同,互成一定角度,形成独立的网路,构成了细胞壁的“经”,模型中的“纬”是结构蛋白(富含羟脯氨酸的蛋白),它由细胞质分泌,垂直于细胞壁平面排列,并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网,径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联,构成更复杂的网路系统。半纤维素和果胶等胶体则填充在网路之中,从而使整个细胞壁既具有刚性又具有弹性。 在次生壁中,纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多,纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则,而且存在木质素(酚类组分的聚合物)的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性,使植物细胞具有很高的机械强度。     
   二、超声波破碎法 
     超声波是物质介质中的一种弹性机械波,它是一种波动形式,因此它可以用于探测人体的生理及病理信息,既诊断超声。同时,它又是一种能量形式,当达到一定剂量的超声在生物体内传播时,通过它们之间的相互作用,能引起生物体的功能和结构发生变化,即超声生物效应。超声对细胞的作用主要有热效应,空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时,摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动,使部分能量转化为局部高热(42-43℃),因为正常组织的临界致死温度为45.7℃,而**组织比正常组织敏感性高,故在此温度下**细胞的代谢发生障碍,DNA、RNA、蛋白质合成受到影响,从而杀伤癌细胞而正常组织不受影响。空化效应是在超声照射下,生物体内形成空泡,随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡,使**出血、组织瓦解以致坏死。另外,空化泡破裂时产生瞬时高温(约5000℃)、高压(可达500×104Pa),可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子,由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应,超声波在传播过程中介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化,引起细胞结构损伤。杀伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相关。    (一)、超声波破碎仪器 
    超声波细胞破碎仪又名超声微波协同萃取仪,超声波细胞裂解仪,超声波纳米材料粉碎机。  
超声波细胞破碎仪的原理并不是太神秘、太复杂。简单说就是将电能通过换能器转换为声能,这种能量通过液体介质而变成一个个密集的小气泡,这些小气泡迅速炸裂,产生的象小炸弹一样的能量,从而起到破碎细胞等物质的作用。 
超声波细胞破碎仪具有破碎组织、细菌、病毒、孢子及其它细胞结构,匀质、乳化、混合、脱气、崩解和分散、浸出和提取,加速反应等功能,故广泛应用于生物、医学、化学、制药、食品、化妆品、环保等实验室研究及企业生产。 超声波细胞破碎仪由超声波发生器和换能器两大部分组成(有的配置有隔音箱)。1、超声波发生器。由信号发生器来产生一个特定频率的信号,这个特定频率就是换能器的频率,一般应用在超声波设备中的超声波频率为20KHz、25KHz、28KHz、33KHz、40KHz、60KHz。 2、换能器组件。换能器组件主要由换能器和变幅杆组成。 3、隔音箱。可以有效地的降低工作过程中的所发出的噪音,保持实验室安静。超声波细胞破碎仪在我**的行业推广已进入成熟阶段,而应用仍不够普及!该仪器(设备)应用范围非常广泛,这是其它仪器设备所不能比拟的。也正因如此,该仪器(设备)的市场潜力很大,所以生产厂家也日趋增多,这也同时造成了超声清洗行业及市场的相对混乱,可以用八个字来形容“鱼龙混杂,良莠不齐”!把超声波细胞破碎仪进行分类。    (二)超声波破碎常见的问题 
    大肠杆菌表达外源蛋白,在超声破碎的时候,用含有1%triton-X-100的PBS悬浮,然后超声的效果较好,1%triton-X-100的作用还是很明显的,对其他的一些细菌同样起作用,比如链霉菌。  
  细菌沉淀直接加样品1buffer,再加5ul的巯基乙醇,混匀,离心,煮沸10min,直接上样,染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。在表达重组蛋白后超声波破碎细胞,采用冰浴,400w,破2s停1s,但是不一会就产生大量泡沫,影响了破碎功率,pbs和tris缓冲液都是这样,**后都是破碎不完全,而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。  1、会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部,约1cm(我一般是距底部0.5mm)。功率根据仪器不同会有所不同,但你可以观察液面,有波动但不要太剧烈就好。2、破3S停10S,破个二三十次看看。 3、变幅杆位置摆放也要注意,听声音如果不对的话就要及时调整。另外可以从菌浓度方面考虑。 在破碎时试着加大体积,强度**好不要超过60%. 4、尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说,你的方法很难散热,导致蛋白变性产生气泡,**好停顿时间稍长一些,这种情况多见于包涵体形式的蛋白。链霉菌(放线菌)超声破碎的,用的方法条件是什么?前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。 使用超声破碎时采用的具体条件是: 
(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r/min 下离心5 min收集菌体.(2)用pH 7.5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次,再用该缓冲液将菌体配成1:3的菌悬液.置于40 mL大塑料试管内.(3)将大塑料试管置于冰浴中,采用超声波破碎(功率200 W,1/2”探头,破碎30 s,间歇30 S).(4)破碎液于12 000 r/min下高速冷冻离心30 min,收集细胞碎片和上清夜. 
超声破菌流程与 上述基本一致,就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris-HCl,洗涤一次就可以。另外,超声剂量随样品量、菌体改变比较大,功率可以到400-600w,超5s,停5s,冰浴,要加终浓度1 mM的PMSF。为确定合适的超声强度和次数,有必要随时镜检观察菌体是否完全破碎。  放线菌属于原核生物系统进化树上的(G+C)摩尔百分含量(mol%)高的革兰氏阳性菌(Eubacteria)分枝类群,它虽然具有原核生物特有的分子生物学特性,但在其不同类群中,细胞壁的化学组分变化很大。 
    在做大肠杆菌超声时,采用的是400W,超5停5的方法,效果不错,但是用在链霉菌上,似乎没什么效果。会不会就是由于细胞壁组成差异造成的呢,因为大肠杆菌式属于革兰氏阴性菌的。 
    再有镜检是检验破碎效果,但是细胞破碎程度和我需要的酶获得之间有正比关系吗?破碎时间长也会影响到酶的活性。所以想问问anaisai战友,你提供的“功率200 W,1/2”探头,破碎30 s,间歇30 S”的条件好像是用于破碎链霉菌孢子的,也可以用于发酵离心后的菌泥吗?如果可以,你破碎的全程时间大概是多少呢?如果你需要的是胞内酶,细胞破碎程度和需要的酶获得之间基本上有正比关系。破碎时间长的确会影响到酶的活性。这就需要在**佳的破碎时间和酶活性之间做出判断,**直接的办法是先绘制相关曲线(酶活性和时间的关系曲线)。     实验中,破碎的是棒状杆菌(也是很难破壁的G+菌),破碎时间控制在30min左右,酶活较好。如果是基质菌丝的话,好可以考虑用溶菌酶处理一下. 一般来讲这几种方法读可以的:  
一,液氮研磨 
二,用french press破碎 三,超声波破碎 
四,溶菌酶处理预处理  
    超声波是物质介质中的一种弹性机械波,它既是一种波动形式,又是一种能量形式。超声对细胞的作用主要有热效应,空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时,摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动,使部分能量转化为局部高热(42-43℃)。空化效应是在超声照射下,生物体内形成空泡,随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡。另外,空化泡破裂时产生瞬时高温(约5000℃)、高压(可达500×104Pa),可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子,由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应,超声波在传播过程中介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化,引起细胞结构损伤。损伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相关。 
    100g大肠杆菌溶于1L破碎液里(破碎掖:50mM Tris-Cl(PH8.5) 5mM EDTA 0.14M NaCl),搅拌,发现菌液发粘,菌体不能够很好分散,用高压匀质机破碎,加压后,菌液不能进入匀质机,速度很慢,请问是何原因?能有好的办法解决,很好用匀质机快速破碎菌体? 将破碎液的量加大,不能很好分散可能是量太大 。超声处理5-10分钟,菌液粘度即可大大降低,也可促进菌体分散。 
不同型号的设备功率不一样,功率的大小决定了使用变幅杆的大小范围(直径2mm**几十毫米),你使用多大的变幅杆就在设备的上调**该刻度(很简单的)!变幅杆的大小决定了处理量5ml一下选3mm,5~50ml可选6~8mm,50ml以上选10mm的变幅杆,依此类推!占空比不用关心的,主要是指超声时间和停顿时间的比值。  酵母破碎的问题 
  一般的PROTOCOL都是用glass beads  破碎酵母细胞sigma G-8772 酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠,效率很高,而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。  
    化学裂解的方法,10g酵母 加1ml的乙酸乙酯,充分搅拌**液体状。此法的裂解效果不错的 加尿素裂解液(尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0),据说效果可以。 毕氏酵母细胞破碎法在破碎遇到的问题是菌体浓度太低,OD620nm在4-6之间。细胞破碎仪的**低破碎体积为4ml左右,这样再稀释一倍,OD就到2-3啦,我们怀疑破碎完溶出蛋白和酶活测定时会测不准。所以请教大家细胞破碎时**低的菌浓多少为下限?我们的菌是一种棒杆菌。 破碎后,你可将液体放入透析袋中浓缩。我们所做的方法是按照1:20的比例将离心后的菌体(e.coli)溶解于超声缓冲液(50mM 磷酸 pH 8.0 )300w 10s/10s 破碎20分钟。做了镜检!基本全被破碎了!我做蛋白纯化的,做的包涵体。实验中我们的菌体浓度相对独立,与培养液中的菌体od无关,不收其限制,便于操作者调控。一般按每g湿菌体加5-10ml裂菌缓冲液。超声肯定会产热,所以一定要有降温装置,除非你需要得成分耐高温。