细胞破碎技术浅谈

某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中,提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离,然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可,其后续分离和纯化都相对简单。但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂,**在细胞内组装来获得生物活性,如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中,其生物活性往往有所改变,此类生物产品是细胞内产品(非分泌型),这些产品主要为医药和保健产品,对于这类产品的提取,需要先应用细胞破碎技术破碎细胞,使细胞内产物释放到液相中,然后再进行提纯,为后续的分离纯化做好准备工作。  
    细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜,使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术,是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展,以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。  
    微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁,细胞壁里面是细胞膜,细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。动物细胞没有细胞壁,仅有细胞膜。通常情况下,细胞壁较坚韧,细胞膜脆弱,易受渗透压冲击而破碎,因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。  
    基于遗传和环境等因素,不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同,故细胞壁的机械强度不同,细胞破碎的难易程度也就不同。此外,不同的生化物质其稳定性有较大差别,在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。因此,破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。  
    (一)机械破碎法  
    机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。  
    1.高压匀浆破碎法  
    Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备,它由可产生高压的泵和排出阀组成,排出阀具有狭窄的小孔,其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内,在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出,并射向撞击环上,由于突然减压和高速冲击,使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上,可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式,也可连续操作。为了控制温度的升高,可在进口处用干冰调节温度,使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中,对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞,常采用多次循环的操作方法。  
    高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎,料液细胞浓度可达到20%左右。团状和丝状菌易造成高压匀浆器的堵塞,不宜使用高压匀浆法。使用高压匀浆法时应注意,高压匀浆器的操作温度上升约2~3℃/10MPa,为了保护目标产物的生物活性,需要对料液作冷却处理。多级破碎操作中,为有效防止温度上升,保护产物活性,需要在级间设置冷却 装置。  
    影响高压匀浆器破碎的主要因素包括压力、温度和通过均浆器阀的次数。升高压力有利于细胞的破碎,这样可以减少细胞的循环次数,在不明显增加通过量的情况下,甚**一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎,可以避免细胞碎片不**过小,从而给随后细胞碎片的分离工作带来好处。在工业生产中,通常采用的压力为55 70MPa。  
    2.高速搅拌珠研磨破碎法  
    研磨是常用的一种方法,它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌,使细胞破碎。在工业规模的破碎中,高速搅拌珠研磨破碎法常利用Dyno珠磨机(高速珠磨机)。水平位置的磨室内放置玻璃小珠,装在同心轴上的圆盘搅拌器高速旋转,使细胞悬浮液和玻璃小珠相互搅动,细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。在料液出口处,旋转圆盘和出口平板之间的狭缝很小,可阻挡玻璃小珠被料液带出。由于操作过程中会产生热量,易造成某些生化物质破坏,故磨室还装有冷却夹套,以冷却细胞悬浮液和玻璃小珠。  
高速搅拌珠研磨破碎法的破碎作用与许多操作参数有关,如搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠的装量和珠体的直径以及温度等。  
  3.超声波破碎法  
  超声波破碎法是利用超声波振荡器发射的15~25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。超声波振荡器有不同的类型,常用的为电声型,它是由发生器和换能器组成,发生器能产生高频电流,换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器可分为槽式和探头直接插入介质两种形式,一般情况下后者比前者破碎效果好。  
    超声波破碎的机理是在超声波作用下液体发生空化作用,空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力,使细胞破碎。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。  
    超声波破碎是很强烈的破碎方法,适用于多数微生物的破碎。超声波破碎的有效能量利用率极低,操作过程产生大量的热,因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。由于对冷却的要求相当苛刻,所以不易放大,主要用于实验室规模的细胞破碎。  
    (二)非机械法破碎方法  
    非机械法破碎法包括酶解破碎法、渗透压冲击破碎法、冻结一融化破碎法、干燥法、化学破碎法和去垢剂破碎法,其中酶解破碎法和化学破碎法应用**广。  
  1.酶解破碎法  
  酶解是用能溶解细胞壁的酶处理菌体细胞,使细胞壁受到部分或完全破坏后,再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜,进一步增大胞内产物的通透性。溶菌酶适用于革兰阴性菌细胞的分解,应用于革兰阴性菌时,需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。真核细胞的细胞壁不同于原核细胞,需采用不同的酶。酶解破碎法的优点是酶解条件温和,能选择性地释放产物,胞内核酸等泄出量少,细胞外形较完整,便于后步分离等。但酶的价格高,故小规模应用较广。  
    自溶作用是酶解的另一种方法,利用生物体自身产生的酶来溶胞,而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中,大多数细胞都能产生一种能水解细胞壁聚合物的酶,使生长过程能够继续下去。改变细胞的生长环境,可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其他的自溶酶,以达到细胞自溶目的。  
    2.渗透压冲击破碎法  
  渗透压冲击也是一种较温和的破碎方法,将细胞放在高渗透压的溶液中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液),由于渗透压的作用,细胞内水分便向外渗出,细胞发生收缩,当达到平衡后,将介质快速稀释,或将细胞转入水或缓冲液中,由于渗透压的突然变化,胞外的水迅速渗入胞内,引起细胞快速膨胀而破裂。  
    3.冻结一融化破碎法  
    将细胞放在低温(约一15℃)下冷冻,然后在室温中融化,反复多次而达到破壁作用。由于冷冻,一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂,从而增加细胞的亲水性能;另一方面胞内水结晶,形成冰晶粒,引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体,可采用此法。  
    4.干燥法  
    经干燥后的细胞,其细胞膜的渗透性发生变化,同时部分菌体会产生自溶,然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时,胞内物质就会被抽提出来。  
    5.化学破碎法  
    采用化学试剂处理可以溶解细胞或抽提胞内的组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂。例如酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸,通常选用浓度为6mol/L的HCI处理。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等。合成的表面活性剂可分离子型和非离子型,离子型如十二烷基磺酸钠(SDS,阴离子型)和十六烷基三甲基溴化铵(阳离子型),非离子型如Triton X一100 和吐温(tween)等。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等。  
    化学破碎法和酶解破碎法一样,也具有对产物的释出选择性好、细胞外形较完整、碎片少、核酸等胞内杂质释放少和便于后步分离等优点,故使用较多。但该法容易引起活性物质失活破坏,因此,根据生化物质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件是非常重要的。另外,化学试剂的加入,常会给随后产物的纯化带来困难,并影响**终产物的纯度,如表面活性剂的存在常会影响盐析巾蛋白质的沉淀和疏水层析,因此**注意除去。  
    (三)目标产物的选择性释放  
    破碎的目的是要得到一种或几种目标产物,因此,在细胞内存在的许多种物质中,选择性释放目标产物,尽量使其他物质少释放出来,并且尽可能降低细胞的破碎程度,对下游分离纯化操作的顺利实施是非常重要的。       
    利用珠磨法破碎酵母细胞时,酵母内各种酶的释放速率常数不同。一般靠近细胞壁和细胞膜的酶释放速度快,而细胞内部或细胞器内的酶随着破碎的进行,缓慢释放出来。因此,选择性地释放目标产物是可能的,**是要知道目标产物的性质和在细胞内存在的位置,选择适当的破碎方法和操作条件。选择性释放目标产物应遵循以下原则。  
    (1)仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围  当目标产物存在于细胞膜附近时,可采用较温和的方法,如酶溶法(包括自溶法)、渗透压冲击法和冻结一融化破碎法等。当目标产物存在于细胞质内时,则需采用强烈的机械破碎法。  
    (2)选择性溶解目标产物  当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时,调节溶液pH值、离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂,如螯合剂、表面活性剂等,使目标产物容易溶解释放。同时,溶液性质应使其他杂质不易溶出。另外机械破碎法和化学破碎法并用可使操作条件更加温和,在相同的目标产物释放率条件下,可降低细胞的破碎程度。  
    (3)包含体的分离和蛋白质复性重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径,开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是,人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难,很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物(如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素一6、人7一干扰素等)不仅不能分泌到细胞外,而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒——包含体。  
    包含体主要由蛋白质构成,其中大多是基因表达产物。这些基因表达产物的一级结构是正确的,但立体结构是错误的,所以没有生物活性。为此,欲获得天然活性态的目标产物,**在分离包含体后,溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以,包含体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度,也为生物化学家的蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。