浅谈细胞破碎技术的简介与进展

摘要: 

本文介绍了细胞破碎方法中已经成熟的为工业所广泛利用的几种基本方式,讨论了各种方法的特点及存在的问题,并对它们进行了比较,以酵母和微藻细胞的破碎方法为例介绍不同细胞破碎方法的选择优化,**后概括了细胞破碎技术的发展方向。 

**词:细胞破碎、方法优化、综述文献 

 

引言: 

目标产物的分离纯化在现代生物技术工业中占有十分重要的位置,它决定着产品的纯度和安全性,也决定着产品的收率与成本。许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外,而保留在细胞内。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎,释放其中的目标产物。 

自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛应用以来,生物技术发生了质的飞跃,生物产品的数量越来越多,许多具有重大应用价值的产品应运而生,如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一2等,它们的基因分别在宿主细胞(如大肠杆菌或酵母细胞)内克隆表达成为基因工程产物,从而提高了产量,降低了成本。很多基因工程产物都是胞内物质 (如上述药物经克隆表达后都属胞内物质),分离提取这类产物时,**将细胞破壁,使产物得以释放,才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的**性步骤,破碎技术的研究更加引起基因工程**和生化工程学者的关注。 

1 资料和方法: 

1.1 资料来源  

由**作者在CNKI进行检索。网址:http://www.cnki.net/。英文资料的检索时间范围为2007/2012;中文资料的检索时间范围为2007/2012。英文检索词为“cell disruption,saccharomycetes,” Microalgae cells;中文检索词为“细胞破碎,酵母菌,微藻细胞”。 1.2 入选标准 

纳入标准:(1)细胞破碎方法的研究与改进。②酵母细胞破碎技术的优化选择。③微藻细胞破碎技术的优化选择。 

排除标准:①与此文目的无关。②较陈旧的文献。③重复同类研究。 1.3 质量评估 

   细胞破碎原著5篇,综述13篇,述评2篇,工业应用20篇。 

2 结果:

2.1 纳入文献基本情况  

初检得到58篇文献,中文37篇,英文21篇。阅读标题和摘要进行初筛,排除因研究目的与此文无关32篇,内容重复性的研究11篇,共保存15篇文献做进一步分析。选取**具代表性的5篇文章进行具体分析。第1~2篇是对细胞破碎技术的研究与进展的综述性文章,第3~4篇研究了酵母细胞破碎方法的研究。第5篇研究了微藻细胞破碎方法的研究。 2.2 细胞破碎技术的简介: 2.2.l细胞破碎技术的分类 

细胞破碎的目的是释出细胞内含物,其方法很多,按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类,图1列出了一些主要方法,表2对细胞破碎方式进行了比较。

表2细胞破碎方法的比较 

机械法中的高速湿法珠磨和高压匀浆法不仅在实验室被广泛采用,而且已经在工业生产中应用,超声破碎法则普遍用于实验室规模;非机械法中的酶溶法和化学渗透法目前实验室研究开发也相当活跃。目前人们仍在探寻新的细胞破碎方法,如激光破碎法、冷冻一喷射法、高速相向流撞击法等,细胞破碎技术的研究有待不断深入和完善。 

2.2.2 各种细胞破碎难易程度 

不同种类的细胞结构差别很大,破碎的难易程度也不同,   由难到易的大致排列顺序为:   植物细胞>真菌(如酵母菌)>革兰氏阳性细菌>革兰氏阴性细菌>动物细胞。 2.2.3 酵母细胞破碎方法的研究 

酵母细胞破碎对酱油、啤酒生产很有意义。在酱油生产中,破碎酵母细胞入醪发酵,缩短发酵周期,酱油质量达优级,符合**家GB18186-2000标准;在啤酒糖化中应用,提高c-氨基酸,增加大米辅料,降低成本。在培养酵母中做添加剂,增加酵母浓度,加速双乙酰还原。在酵母深加工中可提高核酸、核苷酸、嘌呤、嘧啶的得率。酵母细胞破碎方法很多。有化学、生化、超声波、机械研磨,使用果汁匀浆机匀浆破碎,以及近几年诞生的纳米级微生物细胞破碎机的广泛应用。 

下面通过几种细胞破碎方法来比较各个方法的优缺点: 


因而光谱也存在一定的区别。藻胆蛋白是一种从藻类中提取的天然蛋白质,是一种安全无毒的蛋白产品。目前已在许多**域得到应用,如功能食品、天然色素、**治疗和荧光探针等,还作为光敏剂用于光动力治疗癌等方面。高纯度的藻胆蛋白的零售价约为每毫克50美元。 

藻类的细胞壁结构比较复杂,本文所研究的三种藻类均会产生胞外多糖,多黏附在细胞表面上。紫球藻和蔷薇藻都属于单细胞红藻,其生长过程中合成藻红蛋白、胞外多糖等生物活性物质。当藻细胞生长进入稳定期后,大量产生胞外多糖,并逐渐溶入培养液中,使其变得十分黏稠。由于多糖物质的存在,细胞破碎过程会受到一定的影响。此外,藻红蛋白是一种活性物质,在细胞破碎过程中应避免使用变性剂,处理温度以较低为宜。采用溶胀法、反复冻融法、低浓度氯化钙溶液提取法、玻璃珠处理法等四种方法破碎藻细胞。 

下面对四种方法进行比较:

四种方法分析可以得出:溶胀法和冻融法效果明显,藻红蛋白的纯度相对较高。但2次冻融法未能完全破碎藻细胞,不利于胞内活性物质的提取。因而需要增加反复冻融的次数或者采用超声波等其他辅助方法。 2.2.4 细胞破碎方法优化选择 

细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁,使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术,是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。不同细胞类型性质不同,破碎难易程度也不同,而微生物细胞壁的的形状和强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。为了破碎细胞,**克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。 

破碎细胞应考虑的因素有:(1) 对象的细胞结构—不同结构的细胞破碎方法的不同(2) 破碎细胞过程中,对目的物的破坏程度(3) 提取物需要的保护条件  (4)破碎温度。 

2.2.5 细胞破碎新方法的介绍 

微波细胞破碎技术:是利用了细胞不同部位物质对微波吸收能力强弱的差异,其中富含水的部位水分迅速汽化,导致细胞出现孔洞和裂纹,从而使细胞中的有效成分易于释放而被萃取。该技术在微波作用下仅使用了少量的汽化剂,具有溶剂消耗量小,微波利用率高等优点,易于实现工业化。目前**内外对微波细胞破碎提取技术的应用尚未大量展开,据文献报导仅涉及到从酵母细胞中提取海藻糖和从高山红景天中提取红景天甙,由此可见微波细胞破碎提取技术的开发**域十分广阔。山东省中草药资源丰富,有大规模的金银花、黄芩、灵芝及芦荟种植基地,把微波细胞破碎技术应用于这类植物有效成分的提取,在该**域中加强研究,既有现实意义,又有广阔的开发前景。 

细胞破碎微流控芯片:是运用了微机电系统加工技术中的剥离工艺,采用标准光刻胶处理方法,以玻璃为基底,在玻璃上制作了Ti/Pt微电极,将外部的施加低脉冲电压施加在6对微电极上,使微电极产生细胞破碎所需的高场强。同时,还设计了专用的细胞破碎信号发生器,该信号发生器是以C8051F020单片机为核心的硬件电路组成。该信号发生器能实现对芯片施加外部电压信号,该电压信号可实现脉冲宽度,脉冲周期、脉冲电压幅度的调节。该系统制作了电极距离为微米级的微小电极,3V的低脉冲电压就实现了细胞破碎。低电压脉冲信号的宽度不同,其细胞破碎所需的电压和破碎率关联性"细胞破碎率和低电压脉冲信号的宽度。电压幅度和细胞悬浮液的电导率均有关系"通过实现发现干净的聚甲基丙烯酸甲(简称PMMA)与芯片的玻璃衬底形成了半封闭沟道,该沟道可以较好的防止施加低脉冲电压时产生气泡,实验表明产生的气泡与细胞悬浮液的电导率有关联",这种基于MEMS技术设计的细胞破碎微流控芯片系统,实现了在低电压脉冲信号的作用下使细胞以较高的破碎率进行了破碎,并且实现了在线检测细胞破碎率"该系统具有操作简单!所需破碎的脉冲电压低!制作成本低!微型化等优势" 2.2.6 细胞破碎技术的进展 

**先对不同的细胞破碎方法进行具体比较: 

不同规模的需要。而其它技术主要是在实验室使用,但由于某些技术对特定的产物和生物细胞有很好的适用性,在工业上应用也获得了成功。因此,细胞破碎技术的选择还需依据具体的产物和细胞特性与破碎技术的适应性进行综合考虑来决定。 

每种细胞破碎技术都有不足和应用的局限性。即使工业上应用的破碎技术,如球磨破碎、冷压释放破碎和高压释放破碎等,虽然有破碎效率高、成本低、简便等优点,但也有其不足,如因细胞破碎度高,胞内含物全部释放,大量的杂蛋白和核酸的释放使破碎物粘度很高,给后序的固-液分离带来困难,给产物分离纯化增加了负担;机械破碎的剪切力高,或因产生大量热量,易造成敏感的生物活性物质的失活。化学法虽然目前主要在实验室内小规模应用,大规模工业应用还存在许多问题,但也有许多独特的优点。因此,细胞破碎技术本身还远未达到完善的地步,还有大量的工作可做。如纳米级微生物细胞破碎机就是对细胞破碎技术的改进。 

近几年有关文献仍然不少,特别是从上游和下游以及细胞破碎技术之间的相互融合和联系出发,发展了一些新的方法。 

主要从两个方面进行改进发展: (1). 由上游解决的技术 

避开细胞破碎工艺:主要是将具有融菌作用的葡聚糖酶基因导入宿主,或利用基因工程技术破坏酿酒酵母的与细胞壁形成有关的KNR4基因,使重组细胞的通透性明显提高,可用于进行胞外蛋白质的生产。 

细胞自溶:为了省略细胞破碎工艺,采用基因修饰法,控制细胞溶解。如质粒EclE1的自杀基因Kil的基因产物可使细胞完全溶解。 

耐高温产品的基因表达 :利用蛋白质工程和基因工程使基因产品具有耐高温的特性,在破碎细胞过程中,不必使用低温冷冻系统,可以节省可观的能耗,降低成本;同时其它杂蛋白因受热变性,这可简化后序的分离纯化工艺。 

控制发酵和细胞培养条件:细胞膜壁的结构和组成与细胞培养的条件,如培养基组成、生长期、pH、温度、溶氧、搅拌等有着密切关系,控制适当条件即可控制细胞耐受破碎的能力。该法在理论上讲比较容易,在实际使用上比较困难,需要做大量的探索工作。 

(2)与下游技术相结合 

将细胞破碎和双水相萃取融合,即在细胞破碎前制备细胞悬浮液时,按双水相组成的要求加入PEG和其它成相组份,利用球磨或其它方法进行细胞破碎。