浅谈细胞破碎

一、前言 
随着重组DNA技术得到广泛应用以来,生物技术发生了质的飞跃。动物细胞培养的产物有的分泌在细胞外,动物细胞培养的产物大多分泌在细胞外培养液中,微生物的代谢产物有的分泌在细胞外,也有许多是存在于细胞内部,例如大肠杆菌表达的基因工程产物、某些酶制剂(如青霉素酰化酶,碱性磷酸酯酶等)。而植物细胞产物,多为胞内物质。为了提取胞内的蛋白质、酶、多肽和核酸等生化物质。**先**收集细胞或菌体,进行细胞破碎。细胞破碎就是采用一定的方法,在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜,设法使胞内产物**大程度的释放到液相中,破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后,再采用不同的分离手段进一步纯化。微生物细胞核植物细胞外层均为细胞壁,细胞壁里面是细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。动物细胞没有细胞壁,仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧,细胞膜脆弱,易受渗透压冲击而破碎。遗传基因和环境等因素,不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同,故壁的机械强度不同,细胞破碎的难易程度也就不同。此外,不同的生化物质其稳定性有较大差别,在破碎过程中应防止变形和被胞内的酶水解。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织,其细胞破碎的难易不一,使用的方法也不相同,如动物脏器的细胞膜较脆弱,容易破碎,植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁,要采取专门的细胞破碎方法。因此细胞破碎是提取胞内产物的**步骤,破碎方法的得当与否,直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。 
二、正文 
不同的细胞器破碎的方法是不同的,因此细胞的分离方法也是有差异的。制备某种生物大分子时,往往需要采用细胞中某一部分为材料;或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子,通常破碎细胞后,先分离各组分,以防干扰,这对制备—些高难度和高纯度的生物大分子是必要的,细胞器的分离,一般采用差速离心法,此法是利用细胞各组分质量大小不同,在离心管不同区域沉降的原理,分离出所需组分,分离得到的细胞器,其纯度可采用电子显微镜法、**学法或测定标志酶活力法进行鉴定。细胞器的分离有时需要将组织细胞破碎,然后根据待分离的细胞器的理化特性,选择适当的分离方法。一般采用差速离心或密度梯度离心的方法达到分离细胞器的目的。 
下面就将介绍几种细胞破碎的方法。 
2.1机械法
2.1.1组织捣碎机 
主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法,常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨****慢处,开动开关后,逐步加速**所需速度。一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等,转速可高达10000rpm/M以上。由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子如核酸则很少使用。 2.1.2 匀浆器 
先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎。匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离。制作匀浆器的材料,除玻璃外,还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。 
    存在的问题;较易造成堵塞的团状或丝状真菌,较小的革兰氏阳性**以及有
些亚细胞器,质地坚硬,易损伤匀浆阀,也不适合用该法处理。 2.1.3 研钵 
多用于细菌或其他坚硬植物材料,研磨时常加入少量石英砂,玻璃粉或其他研磨剂,以提高研磨效果。 2.1.4 细菌磨   
 是一种改良了的研磨器,比研钵具有更大的研磨面积,而且低部有出口。操作时先把细菌和研磨粉调成糊状,每次加入一小勺,研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎。 
2.2物理法 
主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。在生化制备中常用的方法有: 
2.2.1反复冻溶法 
    原理:因突然冷冻,细胞内冰晶的形成及  胞内外溶剂浓度的突然改变而破
坏细胞。 
    方法:将待破碎的细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。 
    特点:此法适用于组织细胞,多用于动物性材料,对微生物细胞作用较差。 
2.2.2 急热骤冷法 
    将材料投入沸水中,维持85-90分钟,**水浴中急速冷却,此法可用于细菌及病毒材料。 
2.2.3 超声波处理   
     用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于
微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,频高于15~20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。其破碎机理:可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及**种类型等因素有关。 
     特点:操作简单,重复性较好,节省时间;多用于微生物和组织细胞的破碎。    
     存在问题:超声波破碎在实验室规模应用较普遍,处理少量样品时操作简便,液量损失少,但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递,散热均有困难,应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。空化作用是细胞破坏的直接原因,同时会产生活性氧,所以要加一些巯基保护剂。 
 
2.3 化学及生物化学法 2.3.1 自溶法  
     在一定PH和适当的温度下,利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的
方法。此过程需较长时间,常用少量防腐剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。 
2.3.2 酶溶法 
     利用各种水解酶,如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶、半纤维素酶、脂酶等,
将细胞壁分解,使细胞内含物释放出来。有些细菌对溶菌酶不敏感,加入少量巯基试剂或8摩尔尿素处理后,使之转为对溶菌酶敏感而溶解。 特点: 
a) 此法适用多种微生物; b) 具有作用条件温和; c) 内含物成分不易受到破坏; d) 细胞壁损坏的程度可以控制。 
    存在的问题:易造成产物抑制作用,这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高,限制了大规模利用。若回收溶酶,则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差,不同菌种需选择不同的酶。有一定局限性,不适宜大量的蛋白质提取,给进一步纯化带来困难。 
2.3.3 化学渗透法  
     某些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂
等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理;化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。     特点:多用于破碎细菌,且作用比较温和;提取核酸时,常用此法破碎细胞。    存在的问题:时间长,效率低;化学试剂毒性较强,同时对产物也有毒害作用,进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂;通用性差:某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。 
2.3.方法比较 
下面我们来具体分析两种较常用的细胞破碎法——超声破碎发和高压匀浆法。 
超声波破碎法在细胞破碎中应用**普及,超声波是物质介质中的一种弹性机械波,它既是一种波动形式,又是一种能量形式。超声对细胞的作用主要有热效应,空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时,摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动,使部分能量转化为局部高热(42-43℃)。空化效应是在超声照射下,生物体内形成空泡,随着空泡震动和其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡。另外,空化泡破裂时产生瞬时高温(约5000℃)、高压(可达500×104Pa),可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子,由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应,超声波在传播过程中介质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化,引起细胞结构损伤。损伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相关。所以如果使用玻璃管,可能会碎裂,而通常使用的是塑料试管。超声破碎操作简便,但是破碎成本高,易引起温度的剧烈上升。在中~大规模操作时,产生的化学自由基能使某些敏感性活性物质失活。对不同菌种的发酵液,超声破碎的效果差别较大。一般地,杆菌比球菌较易破碎,革兰氏阴性细菌细胞比革兰氏阳性细菌细胞较易破碎,对酵母菌的破碎效果较差。随着科研的深入、生产的发展,人们对具有高活性的蛋白质或多肽的需求量越来越大。超声波破碎已不能满足人们的需求。 
而高压细胞破碎原理与超声波破碎原理不同,在高压作用下,样品从高压室高速喷出,速度可达每秒几百米。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上,被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列过程中经历了高速剪切、碰撞和空穴效应等,从而造成细胞的破碎。一般认为压力超过100Mpa就是超高压。在超高压条件下,生物体高分子立体结构中的非共价结合发生变化,使细胞膜破裂,菌体内成分泄漏,生命活动停止,微生物菌体破坏而死亡。所以,超高压均质仪在细胞破碎等方面得到了重视和广泛应用。但是,这种方法也有其弊端,在操作时较易造成堵塞的团状或丝状真菌,较小的革兰氏阳性**以及有些亚细胞器,质地坚硬,易损伤匀浆阀,也不适合用该法处理。 
三、结语 
无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取。